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생물학적 기술
0 조회수 • 3:33 분 • July 8th, 2025
양이온 교환 크로마토그래피는 순 표면 전하를 기반으로 혼합물에서 단백질 분리를 용이
하게 합니다.곤충 세포 단백질 용해물에서 표적 신호 변환기 단백질을 분리하려면 다른 오염 단백질을 포함하는 투석된 표적 단백질 용해물을 얻습니다. 염화나트륨 함유 완충액을 첨가하여 용해물 점도를 낮추고 단백질 용해도를 개선하여 실행 중 크로마토그래피 컬럼 막힘을 방지하는 데 도움이 됩니다.
또한, 단백질의 순 전하가 0인 표적 단백질의 등전점인 pI 아래의 완충 pH는 과도한 수소 이온이 음의 카르복실레이트 그룹에 결합하는 것을 촉진하여 표적 단백질을 양전하를 띤다.
음전하를 띤 그룹에 결합된 가교 아가로스 비드가 포함된 크로마토그래피 컬럼을 조립합니다. 결합 완충액을 첨가하여 컬럼을 평형화하고 컬럼-단백질 상호작용을 최대화합니다. 희석된 용해물을 평형 컬럼에 로드합니다.
양전하가 낮은 오염 단백질보다 양전하를 띤 표적 단백질은 양전하를 덜띤 오염 단백질보다 컬럼의 음전하를 띤 그룹과 상호 작용하고 단단히 결합합니다.
컬럼을 완충액으로 세척하여 결합되지 않은 음전하를 띤 오염 단백질을 제거합니다. 그 후, 용출 완충액을 통과시키면서 점차적으로 이온 강도를 증가시킵니다.
낮은 이온 강도에서는 컬럼의 음성기에 대한 양이온과 단백질 간의 경쟁이 최소화되어 약하게 결합되고 양전하가 덜 전하를 띤 오염 단백질을 용출합니다. 그러나 이온 강도가 증가함에 따라 염이온은 밀접하게 결합된 표적 신호 변환기 단백질과 경쟁하고 단백질과 컬럼 간의 상호 작용을 감소시켜 정제된 분획으로 용출됩니다.
20밀리리터 양이온 교환 컬럼을 3 컬럼 부피의 Buffer G로 세척한 다음 3 컬럼 부피의 Buffer F로 세척하여 준비합니다. 다음으로, 투석된 샘플 20밀리리터를 완충액 E 20밀리리터를 첨가하여 최종 염화나트륨 농도 100밀리몰로 희석하고 샘플을 교환 컬럼에 도포합니다.
한번에 모두 희석하는 대신 소량의 샘플을 희석하는 것이 중요하며, 희석된 샘플은 단백질의 침전을 제한하기 위해 희석 직후 컬럼에 적용해야 합니다.
이전 희석액이 로드 끝에 가까워지면 새로 희석된 샘플로 컬럼을 계속 로드합니다. 그런 다음 일반적으로 3개의 컬럼 부피가 필요한 버퍼 F로 컬럼을 기준선 흡광도 280으로 세척합니다.
버퍼 F에서 65% 버퍼 G까지 400밀리리터 구배로 컬럼에서 단백질을 용리하고 용출액을 6밀리리터 분획으로 수집합니다. 그래디언트가 완료되면 65% 버퍼 G의 추가 1.5 컬럼 부피에 대해 컬럼을 계속 세척합니다.