Size Exclusion Chromatography Based Separation of Bacterial Extracellular Vesicles: A technique to separateing of gram-negative bacterial outer membrane vesicles (박테리아 세포외 소포체의 이질성 집단을 크기에 따라 분리하는 기술)

0 조회수4:51 • July 8th, 2025

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적절한 배양 조건에서 그람 음성 박테리아는 화물을 운반하는 외막 소포(OMV)를 상청액으로 방출합니다. 이 소포는 세포 통신을 매개하는 이질적인 크기의 작은 구형 구조입니다.

OMV의 다양한 크기의 하위 집단을 분획하려면 매트릭스를 지지하기 위해 바닥에 적절한 필터가 있는 빈 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 사용합니다.

정의된 기공 크기의 화학적으로 불활성인 구형 비드로 구성된 겔 여과 매트릭스로 컬럼을 포장하여 크기가 대형 OMV가 유입되지 않도록 최적의 크기인지 확인합니다. 최적의 정제를 위해 비드가 건조되는 것을 방지하기 위해 적절한 완충액으로 컬럼을 평형화합니다.

OMV, 단백질 응집체 및 핵산의 다양한 크기의 하위 집단을 포함하는 박테리아 배양 상청액을 컬럼 상단에 로드합니다. 샘플이 중력에 의해 실행되도록 합니다.

샘플이 컬럼을 통과할 때 기공에 들어갈 수 없는 더 큰 OMV가 겔 비드 사이의 입자 간 공간을 통해 이동하여 먼저 용출됩니다. 한편, 더 작은 OMV는 매트릭스 기공을 관통하고 더 긴 경로를 취하며 나중에 용리됩니다.

크기가 작기 때문에 단백질 응집체와 핵산은 매트릭스의 다양한 기공으로 들어가 컬럼에서 가장 긴 머무름 시간을 갖고 마지막 분획으로 용리됩니다. 별도의 OMV 용출액을 수집하여 추가 분석을 위해 보관합니다.

시작하려면 유리 막대를 사용하여 젤 여과 매체의 스톡 병을 혼합하고 컬럼을 채우는 데 필요한 양과 약 50% 초과분을 유리병에 붓습니다. 구슬이 가라앉도록 하고 여분의 액체를 디캔팅하십시오. 용출 완충액에 비드를 약 70% 겔 및 30% 완충액의 최종 용액에 재현탁하고 진공 상태에서 용액을 탈기합니다.

컬럼을 링 스탠드에 수직 위치로 장착하고 컬럼에 용출 완충액을 채워 벽을 적신 후 약 1cm만 남을 때까지 완충액을 배출합니다. 그런 다음 컬럼이 컬럼 저장소 바닥 아래 약 2cm 높이까지 채워질 때까지 겔 비드를 컬럼에 조심스럽게 피펫팅하는 동시에 비드가 침전되지 않도록 과도한 완충액을 배출합니다.

샘플을 로드하기 전에 진공 상태에서 용출 완충액을 탈기하십시오. 용출 완충액의 컬럼 부피의 약 2배로 컬럼을 세척합니다. 완충액이 겔층 상단에 도달하면 표면을 방해하지 않고 겔층 위에 리터당 100-200나노몰의 외막 소포 샘플 2밀리리터를 조심스럽게 추가하고 샘플이 겔에 들어가도록 합니다.

층을 방해하지 않고 용출 완충액을 컬럼에 천천히 추가하고 컬럼 아래에 50밀리리터 튜브를 놓습니다. 컬럼이 건조되는 것을 방지하려면 컬럼 상단에 용출 버퍼를 동시에 추가합니다.

20밀리리터의 용출액을 수집한 후 컬럼 아래에 1.5밀리리터 튜브 랙을 놓습니다. 각 튜브에 총 96개의 1밀리리터 분획을 수집합니다. 샘플을 수집하는 동안 컬럼에 용출 완충액을 지속적으로 추가합니다. 컬럼을 세척하려면 컬럼을 통해 0.1몰 수산화나트륨 1 컬럼 부피를 실행한 다음 2 컬럼 부피의 용출 완충액을 실행합니다.

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