Size Exclusion Chromatography Based Separation of Bacterial Extracellular Vesicles: A technique to separateing of gram-negative bacterial outer membrane vesicles (박테리아 세포외 소포체의 이질성 집단을 크기에 따라 분리하는 기술)

적절한 배양 조건에서 그람 음성 박테리아는 화물을 운반하는 외막 소포(OMV)를 상청액으로 방출합니다. 이 소포는 세포 통신을 매개하는 이질적인 크기의 작은 구형 구조입니다.

OMV의 다양한 크기의 하위 집단을 분획하려면 매트릭스를 지지하기 위해 바닥에 적절한 필터가 있는 빈 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 사용합니다.

정의된 기공 크기의 화학적으로 불활성인 구형 비드로 구성된 겔 여과 매트릭스로 컬럼을 포장하여 크기가 대형 OMV가 유입되지 않도록 최적의 크기인지 확인합니다. 최적의 정제를 위해 비드가 건조되는 것을 방지하기 위해 적절한 완충액으로 컬럼을 평형화합니다.

OMV, 단백질 응집체 및 핵산의 다양한 크기의 하위 집단을 포함하는 박테리아 배양 상청액을 컬럼 상단에 로드합니다. 샘플이 중력에 의해 실행되도록 합니다.

샘플이 컬럼을 통과할 때 기공에 들어갈 수 없는 더 큰 OMV가 겔 비드 사이의 입자 간 공간을 통해 이동하여 먼저 용출됩니다. 한편, 더 작은 OMV는 매트릭스 기공을 관통하고 더 긴 경로를 취하며 나중에 용리됩니다.

크기가 작기 때문에 단백질 응집체와 핵산은 매트릭스의 다양한 기공으로 들어가 컬럼에서 가장 긴 머무름 시간을 갖고 마지막 분획으로 용리됩니다. 별도의 OMV 용출액을 수집하여 추가 분석을 위해 보관합니다.

시작하려면 유리 막대를 사용하여 젤 여과 매체의 스톡 병을 혼합하고 컬럼을 채우는 데 필요한 양과 약 50% 초과분을 유리병에 붓습니다. 구슬이 가라앉도록 하고 여분의 액체를 디캔팅하십시오. 용출 완충액에 비드를 약 70% 겔 및 30% 완충액의 최종 용액에 재현탁하고 진공 상태에서 용액을 탈기합니다.

컬럼을 링 스탠드에 수직 위치로 장착하고 컬럼에 용출 완충액을 채워 벽을 적신 후 약 1cm만 남을 때까지 완충액을 배출합니다. 그런 다음 컬럼이 컬럼 저장소 바닥 아래 약 2cm 높이까지 채워질 때까지 겔 비드를 컬럼에 조심스럽게 피펫팅하는 동시에 비드가 침전되지 않도록 과도한 완충액을 배출합니다.

샘플을 로드하기 전에 진공 상태에서 용출 완충액을 탈기하십시오. 용출 완충액의 컬럼 부피의 약 2배로 컬럼을 세척합니다. 완충액이 겔층 상단에 도달하면 표면을 방해하지 않고 겔층 위에 리터당 100-200나노몰의 외막 소포 샘플 2밀리리터를 조심스럽게 추가하고 샘플이 겔에 들어가도록 합니다.

겔

층을 방해하지 않고 용출 완충액을 컬럼에 천천히 추가하고 컬럼 아래에 50밀리리터