박층 크로마토그래피 기반 효소 활성 분석: 박층 크로마토그래피를 사용하여 체외 피로포스포키나제 활성을 측정하는 기술

피로포스포키나제는 아데노신 삼인산(ATP)과 같은 뉴클레오티드 전구체에서 구아노신 이인산(GDP)과 같은 기질로 이인산 또는 피로인산염 전달을 촉매합니다. 이것은 중요한 신호 분자인 구아노신 사인산염을 형성합니다.

피로포스포키나제 활성을 결정하기 위해, 염화마그네슘이 보충된 적절한 완충액에 GDP와 방사성 표지된 ATP를 포함하는 반응 혼합물을 준비한다. 반응 혼합물에 원하는 양의 피로포스포키나제를 첨가하고 배양합니다.

시간이 지남에 따라 마그네슘 이온 존재 하에서 피로포스포키나제는 방사성 표지된 피로인산염 부분을 ATP에서 GDP로 전달하기 시작하여 방사성 구아노신 사인산염을 생성합니다.

이제 얇은 층 크로마토그래피 또는 TLC, 양이온성 폴리머 기반 고정상인 폴리에틸레니민-셀룰로오스로 미리 코팅된 플레이트를 사용합니다. 반응을 멈추고 진행 상황을 평가하기 위해 서로 다른 시점에서 TLC 플레이트 베이스 근처에 반응 혼합물 분석물의 분취량을 배치합니다.

이동상 용매인 일염기성 인산칼륨이 들어 있는 유리 챔버에 플레이트를 담그십시오. 용매 전면이 위쪽으로 이동함에 따라 음전하를 띤 분석물은 양전하를 띤 고정상과의 친화성에 따라 이동하기 시작합니다.

서로 다른 인산화 분석물의 음전하와 중량의 차이는 TLC 플레이트에서의 상대적 이동을 결정하여 별개의 밴드로 고정할 수 있도록 합니다.

용매 전면이 원하는 거리에 도달하면 플레이트를 제거하고 자연 건조시킵니다. 피로포스포키나제 활성을 분석하기 위해 방사성 표지 ATP 고갈 및 구아노신 사인산 축적에 해당하는 방사성 신호 강도를 측정합니다.

반응을 수행하기 전에 PEI-셀룰로오스 박층 크로마토그래피 플레이트를 탈이온수로 세척하여 준비합니다. 플레이트를 이중 증류수가 담긴 유리 챔버에 약 0.5cm 깊이까지 놓습니다. 물이 접시 상단으로 이동하도록 한 후 접시를 유리 챔버에서 꺼내 탁상용 선반에 올려 밤새 건조시킵니다.

부드러운 연필로 한쪽 가장자리에서 2cm 떨어진 곳에 건조판을 표시하여 샘플이 TLC에 적용될 위치를 나타냅니다. 2마이크로리터 샘플의 경우 샘플을 1cm 이상 간격으로 적용합니다. 실험을 계획할 때 항상 각 플레이트에 한 지점을 사용하지 않은 상태로 두어 샘플 정량화를 위한 빈 레인 역할을 하십시오.

효소 활성 분석을 수행하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 ^γ-32P-ATP를 사용하여 개별 반응을 준비합니다. 뉴클레오티드 함유 혼합물에 RSH를 첨가하