헤드스페이스 가스 크로마토그래피: 제브라피시 배아의 에탄올 농도를 평가하는 기법

휘발성 유기 화합물인 에탄올의 농도를 분석하려면 균질화된 에탄올 처리된 제브라피쉬 배아 배양 상청액을 크로마토그래피 바이알에 담아 복용하는 것부터 시작합니다. 상청액에는 에탄올 외에 다른 비휘발성 유기 화합물이 포함되어 있습니다. 밀봉된 바이알을 크로마토그래피 어셈블리의 샘플러 장치에 넣고 적절한 온도에서 가열합니다.

가열하는 동안 에탄올은 기화되어 기체상 또는 헤드스페이스로 이동하여 비휘발성 잔류물을 남깁니다. 이를 통해 샘플러는 운반 가스의 연속 흐름에 기체 에탄올을 도입 할 수 있습니다. 이것은 이동상 역할을 합니다.

에탄올은 액체 고정상의 충전층을 포함하는 예열된 코일 크로마토그래피 컬럼을 통과합니다. 휘발성과 극성으로 인해 움직이는 에탄올 분자는 고정상 입자 위에 흡착되기 시작하여 고정상으로 분할됩니다.

높은 컬럼 온도로 인해 에탄올 분자의 흡착은 불안정하고 일시적이므로 이러한 분자는 운반 가스 흐름을 따라 점차적으로 탈착되고 이동합니다. 이러한 에탄올 분자는 컬럼 길이 전체에 걸쳐 일련의 흡착-탈착 사건을 겪습니다.

그 후, 에탄올은 결과 크로마토그램의 곡선 아래 면적에 해당하는 샘플의 농도를 결정하는 데 도움이 되는 검출 챔버로 들어갑니다.

50마이크로리터로 설정된 p200 마이크로피펫 2개를 사용하고 프로테아제 칵테일 용액을 하나로, 물을 두 번째로 흡인합니다. 그런 다음 유리 피펫을 사용하여 10개의 배아를 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 빠르게 넣고 캡을 닫습니다. 테스트할 모든 샘플, 대조군 및 에탄올 처리된 배아에 대해 이 과정을 반복합니다.

한 번에 하나의 샘플로 작업하면서 캡을 빠르게 열고 200마이크로리터로 설정된 p200 마이크로피펫으로 모든 잔여 배아 배지를 흡인합니다. 빠르고 부드럽게 50마이크로리터의 물을 넣고 제거한 다음 50마이크로리터의 프로테아제 칵테일을 넣고 튜브 캡을 닫습니다.

샘플을 실온에서 10분 동안 그대로 둔 다음 450마이크로리터의 5몰 염화나트륨을 빠르게 첨가하고 튜브 캡을 닫습니다. 10분 동안 와돌려 시료를 균질화하고 2마이크로리터의 상청액을 가스 크로마토그래피 바이알로 옮깁니다. 폴리테트라플루오로에틸렌 캡으로 바이알을 밀봉합니다.

시작 방법을 완료한 후 436 Current spme ethanol 2013 3분 흡수 2_5min rg 실행을 로드합니다. 분석 소프트웨어의 방법 메뉴에서 샘플 목록의 각 샘플에 대한 METH. 공기, 물, 5몰 염화나트륨 프로테아제 칵테일 블랭크부터 시작하여 샘플 목록을 작성하십시오. 그런 다음 에탄올 표준물질을 0.3125에서 40밀리몰 순으로 입력합니다.

두 번째 블랭크 라운드로 표준을 따르십시오. 테스트할 모든 균질화된 배아 상청액 샘플을 가장 낮은 예측 에탄올 농도에서 가장 높은 것으로 입력하고 세 번째 블랭크를 입력하여 마무리합니다.

가스 크로마토그래피 바이알을 샘플이 입력된 순서대로 자동 시료 주입기에 추가하고 10-15분 동안 데우십시오. 그런 다음 소프트웨어를 사용하여 샘플 실행을 시작합니다. 모든 실행이 완료되면 샘플 목록에 최종 샘플을 추가하고 대기를 실행하여 종료 방법을 활성화합니다. 필로폰. 샘플 실행 중에 수집된 모든 데이터를 백업합니다.

종료 방법이 완료되면 크로마토그램 열기를 클릭하고 결과가 있는 폴더를 엽니다. 샘플은 이 프로그램에 자동으로 통합됩니다. 결과에서 올바른 피크가 통합되었는지 확인하십시오. 모든 샘플이 확인되면 결과를 인쇄하거나 내보냅니다.

에탄올 표준의 피크 높이를 그래프에 표시합니다. 그런 다음 기울기, Y절편 및 R제곱 값을 계산합니다. 표준의 Y-절편에서 샘플의 피크 높이를 빼고 이 값을 표준의 기울기로 나누어 각 샘플의 에탄올 값을 얻습니다.

배아의 에탄올 농도를 계산하려면 각 샘플의 희석 계수를 계산하고 샘플 에탄올 값에 이 희석 계수를 곱합니다. 마지막으로, 배지 에탄올 값에 희석 계수 10을 곱하여 배지 참조 샘플을 계산합니다.