단백질 분석을 위한 Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel 전기영동: 분자량에 따라 단백질을 분리하고 시각화하는 기술

먼저 세

제인 도데실 황산나트륨, SDS 및 환원제인 베타-메르캅토에탄올을 포함하는 변성 완충액으로 단백질 샘플을 처리합니다. 잠시 데우십시오. 이 단계에서 베타-메르캅토에탄올은 이황화 결합을 방해하여 단백질에 접히지 않은 형태를 만듭니다.

노출된 소수성 아미노산을 가진 풀린 단백질은 음전하를 띤 SDS에 결합하여 균일한 음전하를 얻습니다. 실시간 시각화를 위해 샘플에 적절한 추적 염료를 추가합니다.

이제 샘플과 표준 분자 크기 마커를 스태킹 겔(저농도의 가교 아크릴아미드 폴리머를 포함하는 폴리아크릴아미드 겔의 최상층)에 존재하는 별도의 웰에 로드합니다.

완충액으로 채워진 젤 장치를 전원 공급 장치에 연결합니다.

전기장이 있는 상태에서 음전하를 띤 단백질은 양극을 향해 자유롭게 이동하고 함께 쌓여 분해 겔(고농도 겔을 포함하는 하층)으로 들어갑니다.

분해 겔에서 단백질은 분자 크기에 따라 이동하기 시작하고, 더 작은 단백질은 빠르게 이동하여 최적으로 분해된 단백질 밴드를 생성합니다. 그런 다음 실행을 중지하고 젤을 제거합니다.

단백질의 염기성 아미노산에 정전기적으로 결합하여 파란색을 부여하는 음이온 염료인 쿠마시 블루로 젤을 염색합니다. 그런 다음 더 나은 시각화를 위해 아세트산 용액에서 겔을 탈색합니다.

겔을 제거하고 추정 분자량을 기반으로 분리된 단백질을 식별합니다.

텍스트 원고에 설명된 대로 두 개의 분리 젤을 준비합니다. 1밀리리터 피펫을 사용하여 유리판 사이에 젤을 붓고 상단 2cm에 혼합물이 없도록 합니다. 분리 겔 위에 70% 에탄올을 첨가하여 두 층 사이에 균일한 계면을 만듭니다.

분리 겔이 중합되면 텍스트 원고의 지침을 사용하여 스태킹 겔을 준비합니다. 그런 다음 분리 젤에서 에탄올을 제거하고 스태킹 젤 용액을 추가합니다. 기포가 생기지 않고 원하는 수의 포켓이 있는 빗을 조심스럽게 삽입하고 젤이 20-30분 동안 중합되도록 합니다.

각 샘플의 4마이크로리터와 단백질 사다리를 별도의 웰에 로드합니다. 그런 다음 Tris-Glycine 러닝 완충액에서 실온에서 45분 동안 144V에서 겔을 실행합니다. 예열된 페어뱅크스 용액 A를 사용하여 로커에서 젤을 30분 동안 염색하고, 예열된 페어뱅크스 용액 D를 사용하여 원하는 배경이 될 때까지 로커에서 젤을 탈색합니다.