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시작하려면 요소를 함유한 로딩 염료와 혼합된 형광 표지된 인산화 및 비인산화 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함하는 샘플을 채취합니다. 샘플을 가열합니다.
강한 변성제인 요소는 열과 결합하여 2차 RNA 구조를 변성시켜 선형화되고 구조화되지 않은 형태를 초래합니다. 이제 아크릴아미드-비아크릴아미드 용액을 요소와 혼합하여 겔을 주조합니다.
촉매인 테트라메틸렌 디아민과 산화제인 과황산암모늄을 첨가하여 후속 겔 중합을 촉진합니다.
용액을 사전 조립된 카세트 장치에 붓습니다. 빗을 삽입하여 샘플 로딩을 위한 웰을 만듭니다. 젤이 중합되도록 합니다. 카세트를 젤 장치에 넣습니다. 상부 및 하부 저장소에 실행 완충액을 추가하여 전체 겔을 통한 전류 흐름을 유지합니다. 빗을 제거합니다.
시각화 염료와 혼합된 샘플을 웰에 넣고 젤을 원하는 전압의 전원 공급 장치에 연결합니다. 겔의 요소는 RNA 분자가 선형 종으로 이동할 수 있도록 합니다.
젤은 체 역할을 하여 음전하를 띤 RNA 분자가 기공을 통해 양극을 향해 이동할 수 있도록 합니다. 실행 중에 본질적으로 더 음성인 인산화 RNA는 인산화되지 않은 RNA보다 더 빠르게 움직입니다.
형광 표지 RNA의 검출을 위해 겔을 이미지화합니다. 인산화되지 않은 RNA에 비해 더 낮은 밴드로 나타나는 더 빠르게 이동하는 인산화 RNA 사이의 이동성 이동을 관찰하십시오.
15% 변성 아크릴아미드 겔 용액을 준비하려면 미리 혼합된 40% 29:1 아크릴아미드/비스-아크릴아미드 용액 22.5밀리리터, 10X TBE 6밀리리터, 요소 28.8g, RNase가 없는 물을 총 부피 59밀리리터로 결합합니다. 그런 다음 용액을 부드럽게 저어줍니다.
용액을 전자레인지에 20초 동안 가열하고 저어준 후 즉시 전자레인지에 다시 돌려 20초 더 굽습니다. 요소가 완전히 녹을 때까지 용액을 부드럽게 저어줍니다. 유리 비커를 찬물이 담긴 얕은 수조에 5분 동안 넣고 유리 비커를 둘러싼 찬물 수위가 유리 비커 내부의 용액 수위보다 높은지 확인합니다. 용액이 식으면 0.22마이크로미터 일회용 여과 장치로 여과하고 가스를 제거하여 미립자와 미세한 기포를 제거합니다.
짧고 긴 유리판을 비누와 물로 씻으십시오. 그런 다음 각 접시에 95% 에탄올을 뿌리고 유리를 닦아 수분을 제거합니다. 긴 접시를 상자 위에 올려 벤치 탑에서 들어 올립니다. 그런 다음 플레이트의 긴 가장자리를 따라 0.4mm 스페이서를 배치합니다. 짧은 판을 긴 판 위에 놓고 짧은 판, 긴 판 및 스페이서의 가장자리가 정렬되었는지 확인합니다. 그런 다음 3개의 균일한 간격의 금속 클램프로 각 측면을 고정합니다.
아크릴아미드 용액에 24마이크로리터의 TEMED를 넣고 혼합합니다. 그런 다음 600 마이크로리터의 10% APS를 추가하고 즉시 유리판 사이에 용액을 붓습니다.
유리판 샌드위치 사이에 아크릴아미드 용액을 붓는 것은 정말 어려울 수 있습니다. 기포를 피하려면 용액을 붓는 동안 유리판 샌드위치를 두드리십시오.
조심스럽게 유리판 샌드위치 상단에 깨끗한 32웰 빗을 추가하고 아크릴아미드가 30분 동안 중합되도록 합니다.
젤을 실행하려면 열 블록을 섭씨 75도로 설정하고 금속 클램프를 제거한 다음 유리판 샌드위치를 철저히 세척하고 건조시킵니다. 짧은 플레이트가 앞을 향하도록 플레이트 샌드위치를 겔 장치에 배치하고 100mL의 10X TBE와 1.9리터의 RNase가 없는 물을 결합하여 0.5X TBE 러닝 완충액을 준비합니다.
600밀리리터의 러닝 버퍼를 장치의 상부 및 하부 챔버에 추가합니다. 젤에서 빗을 부드럽게 제거하고 주사기로 우물을 철저히 헹굽니다. 젤을 50와트에서 30분 동안 사전 실행합니다. 그런 다음 우물을 다시 헹굽니다.
담금질된 반응을 펄스 회전시키고 섭씨 75도에서 3분 동안 배양합니다. 펄스 스핀을 반복하고 즉시 각 샘플 10마이크로리터를 젤에 로드합니다. 그런 다음 젤을 50와트에서 3시간 동안 실행합니다. 실행이 완료되면 전원 공급 장치를 끄고 장치의 상부 챔버를 비우십시오.
유리판 샌드위치의 바깥쪽을 씻고 말립니다. 그런 다음 호일로 덮고 이미징을 위해 레이저 스캐너로 옮깁니다. 유리판 샌드위치를 레이저 스캐너의 스테이지에 장착하고 원하는 형광단에 대한 여기 및 방출 파장을 설정한 다음 겔을 이미지화합니다.