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생물학적 기술
0 조회수 • 3:10 분 • July 8th, 2025
온전한 서브유닛을 가진 호흡 사슬의 5개 미토콘드리아 복합체를 분석하려면 순한 비이온성 세제에 용해된 미토콘드리아 복합체를 얻습니다. 음이온 염료인 Coomassie Blue-G를 함유한 완충액과 혼합합니다.
쿠마시는 세제를 대체하고 복합체에 비특이적으로 결합하여 음전하를 부여하고 파란색으로 염색합니다. 또한 쿠마시는 복합체가 응집하는 것을 방지하고 고유한 구조와 기능을 보존하는 데 도움이 됩니다.
전기영동 탱크에서 길이를 따라 기공 크기가 감소하는 구배 분해 젤로 구성된 겔 카세트를 큰 기공 크기의 스태킹 젤로 겹쳐 조립합니다. 양극 및 음극 챔버를 냉각된 양극과 Coomassie 함유 음극 완충액으로 채웁니다.
쿠마시 결합 단백질 복합체 혼합물로 웰을 로드합니다. 전기영동을 시작합니다.
음전하를 띤 단백질 복합체는 스태킹 겔에서 구배 분해 겔로 양전하를 띤 양극을 향해 이동합니다. 작은 복합체는 기공을 통해 빠르게 통과하는 반면, 큰 복합체는 분해 젤 아래로 이동할 때 제한된 기공 크기로 인해 속도가 느
려집니다.실행 중에 복합체에서 해리된 쿠마시는 음극 완충액의 쿠마시로 치환되어 복합체가 겔의 해당 위치에서 이동하는 것을 방지합니다. 전기영동 후 겔을 시각화합니다. 미토콘드리아 복합체는 크기에 따라 분해된 파란색 띠로 나타납니다.
분자량이 가장 낮은 복합체 II가 겔에서 가장 낮은 위치를 차지하고 복합체 IV, III 및 V가 그 뒤를 잇습니다. 분자량이 가장 높은 복합체 I이 최상위 위치를 차지합니다.
청색 천연 겔 전기영동을 수행하려면 먼저 청색 음극 완충액을 겔 카세트에 추가합니다. 피펫을 사용하여 웰을 세척하고 파란색 음극 완충액으로 채웁니다. 그런 다음 5-30마이크로그램의 단백질 샘플을 웰에 로드합니다. 젤 카세트를 파란색 음극 완충액으로 위쪽으로 부드럽게 채우고 탱크에 양극 완충액을 채웁니다.
먼저 젤을 40볼트의 정전압에서 15분 동안 실행합니다. 그런 다음 전압을 80볼트로 높입니다. 염료가 젤 길이의 2/3에 도달할 때까지 젤을 실행합니다. 파란색 음극 완충액을 음극 완충액으로 교체하고 염료 전면이 겔에서 흘러나올 때까지 전기 영동을 계속합니다.