모세관 전기영동: 형광 표지된 중합효소 연쇄 반응 앰플리콘을 분석하는 기법

모세관 전기영동을 사용하여 DNA 단편의 크기를 결정하려면 먼저 멀티웰 분석 플레이트를 사용합니다. 각 웰에는 형광 표지되고 크기가 다른 PCR 앰플리콘(PCR 주기 후에 얻은 이중 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드)이 포함되어 있습니다.

크기 표준 역할을 하는 몇 가지 크기의 이중 가닥 DNA 단편을 웰에 추가합니다. 이러한 각 DNA 분자는 쉽게 식별할 수 있도록 형광 태그를 가지고 있습니다.

강한 변성제인 포름아마이드를 우물에 보충하고 고온에서 가열합니다. 이 단계는 DNA를 변성시켜 젤 기공을 통해 쉽게 이동할 수 있는 단일 가닥 단편을 형성합니다.

모세관 시스템 내부에 사전 주입된 폴리머 젤이 포함된 조각 분석기 장치에 플레이트를 놓습니다.

고전압을 가하여 우물의 DNA를 음극(음극 말단)의 얇은 직경의 모세관으로 전기동학적으로 도입합니다. 음전하를 띤 DNA 분자는 양전하를 띤 양극을 향해 이동합니다. 짧은 DNA 가닥은 마찰력이 적고 긴 DNA 가닥보다 겔을 통해 더 빠르게 이동합니다.

전기 이동 중에 DNA는 레이저 빔의 경로를 가로질러 염료가 형광을 발하게 합니다. 염료의 방출 신호는 검출기에 의해 포착되고 나중에 각 형광 DNA를 다른 색상의 개별 피크로 나타내는 그래프인 전기 페로그램으로 변환됩니다.

알려지지 않은 DNA 단편 피크를 참조 피크와 비교하여 크기를 분석합니다.

PCR 앰플리콘을 확인한 후 새 PCR 스트립 또는 플레이트를 사용하여 PCR 산물을 정제수에서 1-10으로 희석합니다. 소용돌이와 원심분리기를 잠깐 수행합니다. 흄 찬장에서 작업하는 동안 포름아미드와 참조 크기 표준 용액으로 구성된 원심분리기 튜브에 마스터 믹스를 준비합니다.

분석할 PCR 산물의 수에 따라 원고에 자세히 설명된 대로 시약 부피를 사용합니다. 10%의 잉여 볼륨을 허용합니다.

사용

가능한 모세관 전기영동 시스템에 적합한 PCR 플레이트의 개별 웰에 9.5마이크로리터를 잠깐 소용돌이치고 분배합니다. 그런 다음 0.5마이크로리터의 희석된 PCR 산물을 추가합니다. 밀봉하고 원심분리합니다.

그런 다음 샘플이 들어 있는 플레이트를 PCR 열 순환기에 넣고 샘플을 섭씨 95도에서 3분 동안 변성시킨 후 섭씨 4도까지 무기한 냉각합니다. 1,000 x g에서 1분 동안 원심분리합니다. 씰을 조심스럽게 제거하고 제조업체의 지침에 따라 보정된 모세관 전기영동 시스템에 플레이트를 로드합니다.

선택한 장치에 적합한 시약을 사용하여 단편 분석 모세관 전기영동을 실행하고 원고의 설명에 따라 실행 조건을 조정합니다.