비환원 SDS 페이지: 이황화물 결합 다량체 단백질 복합체를 분석하는 방법

다량체 단백질은 구조적 및 기능적 무결성을 유지하는 데 중요한 시스테인 잔기 사이의 분자간, 공유 결합, 이황화 결합에 의해 안정

화됩니다.

비환원 PAGE로 이러한 복합체를 분석하려면 원하는 농도의 이황화 안정화 단백질을 섭취하십시오. 비환원성 시료 완충액을 추가하고 시료를 가열합니다.

이 완충액에는 단백질에 전반적인 음전하를 부여하는 SDS와 젤 내 움직임을 시각화하는 추적 염료가 포함되어 있습니다. 완충액에는 환원제가 없어 이황화 결합이 손상되지 않은 상태로 유지되어 다량체 복합체가 손상되지 않은 상태로 유지됩니다.

개별 복합체를 원하는 비율의 폴리아크릴아미드 겔 웰에 넣고 젤 장치에 미리 조립합니다. 다른 우물에 알려진 크기의 단백질 사다리를 추가합니다. SDS 기반 실행 버퍼에 우물을 담그고 장치를 전원 공급 장치에 연결합니다.

전류는 음전하를 띤 단백질 복합체가 겔의 기공을 통해 양극(양극 단자)을 향해 이동하도록 강제합니다. 단백질 복합체는 균일하게 음전하를 띠기 때문에 크기에 따라 분리가 발생하며, 여기서 다량체는 특정 위치에서 눈에 띄는 고분자량 밴드를 형성합니다.

분리된 단백질 밴드의 크기를 사다리와 비교합니다. 겔에 저분자량 밴드가 없으면 온전한 다질체 복합체의 성공적인 분리가 확인됩니다.

25밀리몰 트리스, 192밀리몰 글리신 및 부피당 0.1% 중량의 SDS를 혼합하여 1L 1X Tris-글리신 러닝 완충액을 준비합니다. 그런 다음 SDS-PAGE 실행 장치를 설정합니다.

제조업체의 프로토콜에 따라 16% 프리캐스트 TGX SDS-PAGE 패키지를 열고 카세트를 제거합니다. 우물을 감싸고 있는 빗과 카세트 바닥의 테이프를 제거하고 젤을 작동 장치에 넣습니다. 웰이 액체에 잠길 때까지 챔버를 1X 실행 완충액으로 채웁니다.

플라스틱 피펫을 사용하여 실행 완충액으로 우물을 헹굽니다. 샘플을 사전 염색된 표준 마커 10마이크로리터와 함께 젤에 로드합니다. 마지막으로 염료 전면이 젤 바닥에서 약 200cm 떨어질 때까지 젤을 1볼트에서 실행합니다.