마우스에 영구 중간 대뇌 동맥 내고의 응용

본 실험 절차의 전반적인 목표는 동물 모델에서 국소 뇌허혈을 연구하는 것입니다. 먼저 왼쪽 눈과 귓바퀴 기저부 사이의 피부를 작게 절개합니다. 다음으로, 중대뇌동맥을 노출시키기 위해 관골궁과 인골의 접합부에서 개두술을 수행하며, 그 후 소혈관 소작기를 사용하여 중대뇌동맥을 결찰합니다.

마지막으로, 피부를 봉합하여 상처 부위를 닫습니다. 결과적으로 생쥐 뇌의 좌반구에 경색이 위치한 결과를 얻을 수 있습니다. 뇌졸중을 시각화하기 위해 뇌를 TTC로 염색하거나 MRI를 사용하여 스캔할 수 있습니다.

뇌졸중 뇌 조직은 단백질 또는 mRNA 발현 분석에도 사용될 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 로체스터 대학교의 Gale Johnson 실험실 대학원생인 Garza Chola입니다.

이 방법은 허혈성 뇌 내의 세포 사멸을 유도하는 메커니즘을 설명하는 것과 같이 뇌졸중 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 수술 준비를 위해 모든 수술 도구, 거즈 스펀지 및 인지 어플리케이터를 오토클레이브로 멸균하십시오. 수술 중에는 수술 도구를 70% ethanol에 담가 두었다가, 사용 직전에 멸균 거즈 위에서 자연 건조하십시오.

수술 2시간 전에 작업 구역에 70% ethanol을 분무합니다. 마우스에 buprenorphine 0.05 milligrams per kilogram을 주입합니다. 약물은 수술 직후에 다시 투여하며, 이후 수술 후 첫 24시간 동안 3~5시간마다 투여합니다.

마취 기화기를 사용하여 3% ISO fluorine과 20% 산소 혼합 가스로 마우스에 마취를 실시합니다. 유량계를 사용하여 산소량을 조절합니다. 발가락이나 꼬리를 집어 마취 수준을 확인합니다.

2% ISO fluorine로 마취 수준을 유지합니다. 마우스의 눈에 인공 눈물을 점안하고, 수술 과정 중 눈이 손상되지 않도록 주의하십시오.

동물용 클리퍼를 사용하여 마우스를 오른쪽으로 눕혀 측면 자세로 배치합니다. 왼쪽 눈과 왼쪽 귀 기저부 사이의 왼쪽 영역을 면도합니다. 면봉을 사용하여 Betadine 용액과 70% eth ethanol을 교대로 묻혀 해당 부위를 가볍게 문지르며 세척합니다.

반복이 필요합니다. 직장 프로브(rectal probe)가 연결된 가열 패드 위에 마우스를 놓습니다. 체온을 37 °C로 유지하기 위해 미네랄 오일을 사용하여 직장 프로브를 삽입합니다. 현미경 아래에서 마우스를 오른쪽으로 눕힌 후 테이프로 고정합니다.

거즈 스펀지에 창을 내어 절개 부위를 덮고 세밀한 직선 가위를 사용합니다. 왼쪽 눈과 왼쪽 귀 기저부 사이에 수직 절개를 가합니다. 수술 중 조직의 과도한 건조가 발생하는 경우, 곡선형 지혈 집게를 사용하여 수술 부위를 개방된 상태로 유지하십시오.

면봉을 사용하여 멸균 PBS를 도포합니다. 스프링 가위를 사용하여 측두근에 수평 절개를 가하고, 핀셋으로 천천히 당겨 측두근을 두개골에서 살짝 분리합니다. 곡선 핀셋으로 턱뼈를 잡고 18 gauge 바늘을 사용하여 관골궁과 인골의 접합부에 작은 측두하 개두술을 시행합니다.

골 절단기로 두개골의 일부를 소량 제거하여 MCA를 노출시킵니다. 이 과정에서 관골궁과 안와 내용물이 손상되지 않도록 주의해야 합니다. 소혈관 소작기를 사용하여 MCA의 원위부를 결찰하고, 측두근을 원래 위치로 되돌린 후 5-0 나일론 봉합사로 봉합합니다.

절개 부위를 폐쇄하기 위해 마취를 중단하고 직장 프로브를 제거합니다. 마우스의 피하에 부프레노르핀 2차 용량을 주입합니다. 마우스를 37 °C로 유지된 케이지로 옮깁니다.

가열 패널을 사용합니다. 향후 24시간 동안 식욕 또는 음수량 감소, 구부정한 자세, 호흡수 증가 또는 털 세워짐(piloerection)을 포함하여 마우스의 불편함을 면밀히 관찰하십시오. 수술 직후 마우스에게 회복용 젤을 제공하십시오.

수술 후 2~3시간 동안 대기합니다. 그 다음, 24시간까지 3~5시간마다 쥐의 피하에 buprenorphine을 주사합니다. 수술 24시간 후, 쥐를 깊게 마취시키고 4% TTC로 관류합니다.

뇌를 적출하여 4% paraform aldehyde 용액에 하룻밤 동안 담가 둡니다. 다음 날, 뇌를 절편 제작용 블록에 고정합니다. 면도날을 사용하여 뇌를 1 mm 두께의 슬라이스로 절단합니다.

절편들을 밀리미리터 눈금자와 나란히 배치하십시오. 해부 현미경에 연결된 디지털 카메라를 사용하여 Image J 소프트웨어에서 절편들을 촬영하십시오.

파일 메뉴를 클릭하고 원하는 사진을 엽니다. 프로그램에서 직선 탭을 클릭합니다. 자의 두 가장자리 사이에 직선을 그립니다.

분석(analyze) 메뉴를 클릭하고 스케일 설정(set scale)을 선택하십시오. 알려진 거리를 1로 설정하고 길이 단위를 millimeter로 설정하십시오. 프리핸드 원(freehand circle) 탭을 클릭하십시오.

원형을 그려 대측 반구를 표시합니다. 분석(analyze) 메뉴를 클릭하고 측정(measure)을 선택합니다. 그러면 그려진 원의 면적이 표시되는 계산 창이 나타납니다.

흰색 스트로크 영역을 제외하고 동측 뇌반구 주변에 또 다른 원을 그립니다. 이전과 같이 면적을 측정합니다. 새로운 값이 계산 창에 추가됩니다.

첫 번째 값과 두 번째 값의 차이는 경색 부위의 면적을 나타냅니다. 슬라이스 두께를 1mm로 하여 위의 단계를 반복함으로써 각 슬라이스의 뇌졸중 면적을 계산하십시오. 각 슬라이스에서 계산된 뇌졸중 면적의 합계를 통해 뇌졸중 부피를 계산하십시오.

이 그림은 야생형 C 57 BL six 마우스의 영구적 MCA 결찰 24시간 후 TTC 염색된 뇌를 보여줍니다. 뇌졸중 부위는 흰색으로 나타나며, 다양한 배율과 각도에서 확인할 수 있습니다. 여기에는 전방에서 후방 경색 부위까지 TTC 염색된 뇌졸중 뇌의 1 mm 두께 절편들이 제시되어 있습니다.

부피는 수술 24시간 후에 계산되었습니다. 경색 부위의 부피는 약 23 cubic millimeters입니다. 이 기술은 적절하게 수행될 경우 30분 이내에 완료할 수 있습니다.

시청해 주셔서 감사합니다.