2차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동: 전하와 분자량에 근거를 둔 복잡한 단백질 혼합물에 있는 단백질의 분석을 위한 별거 기술

균질화된 종양 조직에서 유래한 단백질 혼합물의 2차원 겔 전기영동을 위해서는 카오트로퍼, 쌍성이온 세제 및 환원제를 함유한 완충액으로 처리합니다. 카오트로프와 세제는 단백질을 변성시키고 가용화합니다. 환원제는 단백질의 이황화 결합을 환원시켜 유리 티올 그룹을 생성하고 최적의 단백질 분해능을 위해 단백질을 풀어줍니다.

처리된 단백질 혼합물을 고정화된 pH 구배, IPG, 스트립 홀더로 옮깁니다. 선형 pH 구배를 포함하는 IPG 스트립을 아크릴아미드 겔 매트릭스 내에 놓습니다. 단백질 용액 증발을 방지하기 위해 미네랄 오일을 첨가하십시오. 홀더를 등전 초점, IEF 시스템으로 옮깁니다. 단백질 용액이 스트립을 재수화하도록 합니다.

1차원 IEF를 수행합니다. 전류는 하전된 단백질이 pH 구배를 통해 반대 전하를 띤 전극을 향해 이동하게 하여 단백질의 순 전하가 0인 pH인 각각의 등전점에서 고정되도록 합니다.

IEF 후 IPG 스트립을 단백질에 음전하를 부여하는 음이온 세제인 도데실 황산나트륨(SDS)으로 처리합니다. 알킬화제와 평형을 이루어 단백질 티올 그룹을 변형하여 전기영동 중 단백질 용해도를 보장합니다.

스트립을 프리캐스트 작은 기공 폴리아크릴아미드 분해 젤에 로드하고 용융된 아가로스로 고정합니다. SDS 함유 전기영동 완충액으로 챔버를 채웁니다. IEF에 수직인 2차원 전기영동을 시작합니다.

음전하를 띤 분자량이 큰 단백질은 작은 단백질보다 겔을 통해 양전하를 띤 양극을 향해 천천히 이동하므로 크기 기반 분리가 용이합니다.

젤을 염색하십시오. 단백질은 겔에서 개별 반점으로 시각화될 수 있습니다.

이 절차를 시작하려면 이전에 준비된 단백질 샘플 용액 250마이크로리터를 13cm IPG 스트립 홀더의 각 슬롯에 추가합니다. 18cm 길이의 IPG 스트립을 젤 면이 아래로 향하도록 각 단백질 샘플 용액 위에 놓고 기포가 생기지 않도록 주의합니다. 그런 다음 미네랄 오일 3-4밀리리터를 첨가하여 각 IPG 스트립을 덮습니다.

다음으로, 각 IPG 스트립 홀더를 등전 초점 시스템으로 조립하고 뾰족한 끝이 뒷판에 있고 사각형 끝이 전면 플레이트에 있습니다. IPG 스트립을 실온에서 18시간 동안 재수화한 후 총 런타임 7.5시간 및 36,875볼트 시간으로 등전 초점 시스템에서 IEF 매개변수를 설정합니다.

IEF 후 등전 초점 시스템에서 각 IPG 스트립을 꺼내고 불용성 종이 타월로 여분의 미네랄 오일을 제거합니