2차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동: 전하와 분자량에 근거를 둔 복잡한 단백질 혼합물에 있는 단백질의 분석을 위한 별거 기술

균질화된 종양 조직에서 유래한 단백질 혼합물의 2차원 겔 전기영동을 위해서는 카오트로퍼, 쌍성이온 세제 및 환원제를 함유한 완충액으로 처리합니다. 카오트로프와 세제는 단백질을 변성시키고 가용화합니다. 환원제는 단백질의 이황화 결합을 환원시켜 유리 티올 그룹을 생성하고 최적의 단백질 분해능을 위해 단백질을 풀어줍니다.

처리된 단백질 혼합물을 고정화된 pH 구배, IPG, 스트립 홀더로 옮깁니다. 선형 pH 구배를 포함하는 IPG 스트립을 아크릴아미드 겔 매트릭스 내에 놓습니다. 단백질 용액 증발을 방지하기 위해 미네랄 오일을 첨가하십시오. 홀더를 등전 초점, IEF 시스템으로 옮깁니다. 단백질 용액이 스트립을 재수화하도록 합니다.

1차원 IEF를 수행합니다. 전류는 하전된 단백질이 pH 구배를 통해 반대 전하를 띤 전극을 향해 이동하게 하여 단백질의 순 전하가 0인 pH인 각각의 등전점에서 고정되도록 합니다.

IEF 후 IPG 스트립을 단백질에 음전하를 부여하는 음이온 세제인 도데실 황산나트륨(SDS)으로 처리합니다. 알킬화제와 평형을 이루어 단백질 티올 그룹을 변형하여 전기영동 중 단백질 용해도를 보장합니다.

스트립을 프리캐스트 작은 기공 폴리아크릴아미드 분해 젤에 로드하고 용융된 아가로스로 고정합니다. SDS 함유 전기영동 완충액으로 챔버를 채웁니다. IEF에 수직인 2차원 전기영동을 시작합니다.

음전하를 띤 분자량이 큰 단백질은 작은 단백질보다 겔을 통해 양전하를 띤 양극을 향해 천천히 이동하므로 크기 기반 분리가 용이합니다.

젤을 염색하십시오. 단백질은 겔에서 개별 반점으로 시각화될 수 있습니다.

이 절차를 시작하려면 이전에 준비된 단백질 샘플 용액 250마이크로리터를 13cm IPG 스트립 홀더의 각 슬롯에 추가합니다. 18cm 길이의 IPG 스트립을 젤 면이 아래로 향하도록 각 단백질 샘플 용액 위에 놓고 기포가 생기지 않도록 주의합니다. 그런 다음 미네랄 오일 3-4밀리리터를 첨가하여 각 IPG 스트립을 덮습니다.

다음으로, 각 IPG 스트립 홀더를 등전 초점 시스템으로 조립하고 뾰족한 끝이 뒷판에 있고 사각형 끝이 전면 플레이트에 있습니다. IPG 스트립을 실온에서 18시간 동안 재수화한 후 총 런타임 7.5시간 및 36,875볼트 시간으로 등전 초점 시스템에서 IEF 매개변수를 설정합니다.

IEF 후 등전 초점 시스템에서 각 IPG 스트립을 꺼내고 불용성 종이 타월로 여분의 미네랄 오일을 제거합니다. 그런 다음 각 스트립을 플라스틱 랩으로 싸서 섭씨 -80도에서 보관합니다.

12% PAGE 겔을 주조하려면 이중 증류수, 1.5몰 트리스염산 완충액, 40% 아크릴아미드/비아크릴아미드 원액, 10% 과황산암모늄 및 TEMED를 비커에 첨가합니다. 거품이 생기지 않도록 주의하면서 젤 용액을 부드럽게 섞습니다.

젤 용액을 멀티 캐스팅 챔버에 부드럽게 붓고 예상 젤 높이 19cm까지 붓습니다. 즉시 다중 주조 챔버에 약 3밀리리터의 이중 증류수를 첨가하여 각 분해 겔을 덮고 각 겔이 약 1시간 동안 중합되도록 합니다.

이 단계는 고품질 SDS-PAGE 젤을 준비하는 데 매우 중요합니다. 각 젤 상단에 동일한 부피의 물을 즉시 추가해야 합니다.

2리터의 전기영동 완충액을 준비한 다음 완충액을 전기영동 분리 장치 완충액 탱크에 첨가합니다.

집중된 IPG 스트립을 냉동실에서 꺼낸 후 환원 평형 완충액 1ml와 미량의 브로모페놀 블루가 들어 있는 플라스틱 용기에 넣고 부드럽게 흔들면서 10분 동안 평형을 유지합니다. 환원 평형 완충액을 제거한 후 IPG 스트립에 알킬화 평형 완충액 4밀리리터와 미량의 브로모페놀 블루를 첨가하고 부드럽게 흔들면서 10분 동안 평형을 유지합니다.

겔 평형 동안 멀티 캐스팅 챔버를 분해하고 준비된 분해 겔 카세트를 제거합니다. 젤 카세트를 이중 증류수로 세 번 헹구고 불용성 종이 타월로 젤 카세트에서 여분의 물을 제거하고 젤 스탠더에 넣습니다.

그런 다음 평형화된 IPG 스트립을 전기영동 완충액으로 헹구고 불용성 종이 타월로 각 IPG 스트립 표면의 과도한 액체를 제거합니다. IPG 스트립을 분해 SDS-PAGE 젤 위에 놓고 IPG 스트립의 플라스틱 면이 뾰족한 끝이 왼쪽으로 향하도록 더 긴 유리판에 닿도록 합니다.

이제 3-4밀리리터의 뜨거운 1% 아가로스와 SDS 전기영동 완충액을 빠르게 첨가하여 각 SDS-PAGE 겔의 상단에 IPG 스트립을 밀봉하고 IPG 스트립의 윗면을 더 짧은 유리판의 상단에 아래로 놓습니다.

이러한 단계는 IPG 스트립을 SDS-PAGE 젤에 밀봉하는 데 매우 중요합니다. 뜨거운 아가로스 용액을 즉시 첨가해야 하며 IPG 스트립을 SDS 겔 상단에 즉시 배치해야 합니다.

중합 후 조립된 젤 카세트를 플라스틱 개스킷과 수직 전기영동 시스템 사이에 수직으로 삽입합니다. IPG 스트립이 있는 젤 상단을 음극 옆에 놓습니다. 다음으로, 전기영동 시스템에 적절한 양의 완충액을 추가하여 겔 카세트를 담그도록 전기영동 완충액의 수준을 조정합니다.

전원 공급 장치를 정전압 모드로 연결 및 설정하고 염료를 모니터링하면서 약 370분 동안 200볼트에서 작동합니다. 실행이 완료되면 전기영동 시스템에서 젤 카세트를 꺼내 젤이 찢어지지 않도록 주의하면서 젤 카세트에서 젤을 부드럽게 제거합니다.