Zymography Gel Electrophoresis: 효소 활성을 평가하여 기질 금속단백분해효소를 검출하는 전기영동 기법

프로펩타이드와 촉매 도메인을 포함하는 다중 도메인 프로테아제인 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)는 특정 세포에 의해 비활성 효소 또는 자이모겐으로 분비됩니다. 촉매 도메인 아연 이온과 프로펩타이드 도메인 시스테인 잔기 사이의 상호 작용은 MMP를 비활성 상태로 유지합니다.

자이모그래피 겔 전기영동으로 세포 배양 상청액에서 MMP를 검출하려면 겔 카세트가 들어 있는 전기영동 탱크에 도데실황산나트륨 또는 SDS 함유 러닝 완충액을 채웁니다.

로딩 완충액과 혼합된 배양 상청액을 MMP 특이적 단백질 기질과 공중합된 폴리아크릴아미드 겔 웰에 로드합니다.

음전하를 띤 세제인 SDS는 환원되지 않은 조건에서 MMP의 시스테인-아연 상호 작용을 방해하고 음전하를 부여하면서 단백질을 변성시킵니다.

전기영동을 수행합니다. 전기장은 음전하를 띤 단백질을 양전하를 띤 양극으로 이동하여 크기 기반 단백질 분리를 유발합니다.

전기영동 후 비이온성 세제 함유 재생 완충액으로 겔을 처리합니다. 비이온성 세제는 SDS를 대체하여 단백질을 재생하고 MMP 활성을 부분적으로 회복시킵니다. MMP는 완전히 활성 상태로 처리됩니다.

MMP 활성에 필수적인 2가 금속 양이온을 포함하는 현상 완충액에서 배양합니다. 활성 MMP는 양이온과 함께 겔의 MMP 기질을 소화합니다. 젤을 씻어 소화된 제품을 제거합니다. 젤을 염색하십시오.

MMP 기질이 없는 MMP 활성 영역은 소화되지 않은 기질의 진한 파란색 배경에 투명한 띠로 나타납니다. 적절한 소프트웨어를 사용하면 겔 밴드 강도를 MMP 활동과 연관시킬 수 있습니다.

이 프로토콜을 시작하기 전에 효소의 기능을 유지하기 위해 모든 매트릭스 메탈로프로테이나제 또는 MMP를 적절하게 준비합니다. 샘플은 즉시 사용하거나 섭씨 -80도에서 보관할 수 있습니다. 여기서 젤라티나제 A 또는 IV형 콜라게나제라고도 알려진 MMP-2는 자이모그래피를 통해 MMP 활성의 시각화를 입증하는 데 사용됩니다.

MMP 효소가 준비되면 카세트 내부에 젤이 들어 있는 10% 젤라틴 자이모그램 젤 파우치를 얻습니다. 탈이온수로 카세트를 헹굽니다. 카세트 바닥에서 보호 테이프를 제거하고 젤 상단에서 빗을 제거합니다. Tris-Glycine SDS 러닝 버퍼로 웰을 세 번 헹굽니다.

젤을 미니 셀 전기영동 장치에 넣고 카세트의 작은 면이 안쪽을 향하도록 합니다. 젤 텐션 웨지로 젤을 제자리에 고정합니다. 장치의 상단 챔버를 웰 수준 위의 Tris-Glycine SDS 실행 완충액으로 채우고 누출이 있는지 확인합니다. 겔 전기영동 설정의 하부 챔버도 러닝 버퍼로 채웁니다.

그런 다음 10마이크로리터의 단백질 분자 마커를 로드합니다.

환원제를 포함하지 않는 겔 로딩 완충액에 동일한 양의 샘플을 혼합합니다. 일반 SDS-PAGE와 달리 샘플을 끓이지 말고 대신 겔 로딩 팁을 사용하여 겔의 웰에 직접 로드합니다. 이 우물은 최대 20마이크로리터의 부피를 담을 수 있습니다.

미니 셀에 뚜껑을 덮고 전극 코드를 전원 공급 장치에 연결합니다. 전원 공급 장치를 켜고 젤이 125V에서 90분 동안 일정하게 작동하도록 설정합니다. 하부 챔버의 와이어에 전류 순환을 나타내는 작은 기포가 형성되는지 확인하십시오.

첫 번째 겔을 실행할 때 로딩 완충액에 포함된 브로모페놀 블루를 지표로 사용하여 15분마다 이동 진행 상황을 모니터링합니다. 각 겔에 대해 100밀리리터의 1X 자이모그램 재생 완충액과 200밀리리터의 자이모그램 현상 완충액을 모두 탈이온수에 준비합니다.

브로모페놀 블루 추적 염료가 젤 바닥에 도달하면 전원 공급 장치를 끕니다.

미니 셀을 열고 젤을 제거합니다. 젤 나이프를 사용하여 카세트의 양면을 분리합니다. 젤의 방향을 표시하기 위해 모서리를 자릅니다. 카세트에서 젤을 조심스럽게 제거하고 100ml의 재생 완충액이 담긴 용기에 넣습니다.

젤을 실온에서 30분 동안 부드럽게 교반하면서 배양합니다.

재생 완충액을 제거하고 겔에 현상 완충액 100밀리리터를 첨가합니다. 부드럽게 교반하면서 실온에서 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 현상 완충액을 제거하고 100밀리리터의 신선한 현상 완충액을 겔에 추가합니다. 젤을 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.

하룻밤 배양 후, 현상 완충액을 제거하고 게일을 탈이온수와 함께 실온에서 5분 동안 부드럽게 교반하여 배양하여 세척합니다. 이 세탁을 두 번 반복합니다.

젤을 플라스틱 시트 보호기 위에 놓고 기포를 제거합니다. 그런 다음 포토 스캐너로 젤을 스캔하여 젤 염색 후 거의 보이지 않으므로 단백질 표준 밴드의 정확한 위치를 저장합니다.

젤에 20밀리리터의 SimplyBlue SafeStain을 첨가하여 젤을 염색합니다. 젤을 실온에서 부드럽게 교반하면서 1시간 동안 배양합니다.

SimplyBlue SafeStain을 제거하고 실온에서 부드럽게 교반하면서 100밀리리터의 탈이온수에 젤을 탈색합니다.

1시간 후 신선한 탈이온수로 교체하고 젤을 최소 1시간 동안 계속 배양합니다.