Zymography Gel Electrophoresis: 효소 활성을 평가하여 기질 금속단백분해효소를 검출하는 전기영동 기법

프로펩타이드와 촉매 도메인을 포함하는 다중 도메인 프로테아제인 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)는 특정 세포에 의해 비활성 효소 또는 자이모겐으로 분비됩니다. 촉매 도메인 아연 이온과 프로펩타이드 도메인 시스테인 잔기 사이의 상호 작용은 MMP를 비활성 상태로 유지합니다.

자이모그래피 겔 전기영동으로 세포 배양 상청액에서 MMP를 검출하려면 겔 카세트가 들어 있는 전기영동 탱크에 도데실황산나트륨 또는 SDS 함유 러닝 완충액을 채웁니다.

로딩 완충액과 혼합된 배양 상청액을 MMP 특이적 단백질 기질과 공중합된 폴리아크릴아미드 겔 웰에 로드합니다.

음전하를 띤 세제인 SDS는 환원되지 않은 조건에서 MMP의 시스테인-아연 상호 작용을 방해하고 음전하를 부여하면서 단백질을 변성시킵니다.

전기영동을 수행합니다. 전기장은 음전하를 띤 단백질을 양전하를 띤 양극으로 이동하여 크기 기반 단백질 분리를 유발합니다.

전기영동 후 비이온성 세제 함유 재생 완충액으로 겔을 처리합니다. 비이온성 세제는 SDS를 대체하여 단백질을 재생하고 MMP 활성을 부분적으로 회복시킵니다. MMP는 완전히 활성 상태로 처리됩니다.

MMP 활성에 필수적인 2가 금속 양이온을 포함하는 현상 완충액에서 배양합니다. 활성 MMP는 양이온과 함께 겔의 MMP 기질을 소화합니다. 젤을 씻어 소화된 제품을 제거합니다. 젤을 염색하십시오.

MMP 기질이 없는 MMP 활성 영역은 소화되지 않은 기질의 진한 파란색 배경에 투명한 띠로 나타납니다. 적절한 소프트웨어를 사용하면 겔 밴드 강도를 MMP 활동과 연관시킬 수 있습니다.

이 프로토콜을 시작하기 전에 효소의 기능을 유지하기 위해 모든 매트릭스 메탈로프로테이나제 또는 MMP를 적절하게 준비합니다. 샘플은 즉시 사용하거나 섭씨 -80도에서 보관할 수 있습니다. 여기서 젤라티나제 A 또는 IV형 콜라게나제라고도 알려진 MMP-2는 자이모그래피를 통해 MMP 활성의 시각화를 입증하는 데 사용됩니다.

MMP 효소가 준비되면 카세트 내부에 젤이 들어 있는 10% 젤라틴 자이모그램 젤 파우치를 얻습니다. 탈이온수로 카세트를 헹굽니다. 카세트 바닥에서 보호 테이프를 제거하고 젤 상단에서 빗을 제거합니다. Tris-Glycine SDS 러닝 버퍼로 웰을 세 번 헹굽니다.

젤을 미니 셀 전기영동 장치에 넣고 카세트의 작은 면이 안쪽을 향하도록 합니다. 젤 텐션 웨지로 젤을 제자리에 고정합니다. 장치의 상단 챔버를 웰 수준