Multianalyte Immunobead Assay: 인간 혈청 샘플에서 여러 항체 아형을 동시에 검출하기 위한 흐름 기반 면역분석 기법

다중 분석물 면역비드 분석은 여러 항원 코팅 마이크로스피어를 사용하여 해당 표적 항체를 동시에 인식합니다.

이 분석을 시작하려면 적절한 완충액이 들어 있는 튜브에 마이크로비드의 혼합물을 섭취하십시오. 각 비드는 표면에 특정 항원으로 코팅되어 있어 비드를 서로 쉽게 구별할 수 있습니다.

코팅된 면역구슬 혼합물을 마이크로타이터 분석 플레이트의 웰에 피펫팅합니다. 표적 항체의 다양한 이소형을 포함하는 혈청 샘플로 웰을 보충합니다. 이러한 변이체는 구조에 미묘한 차이가 있어 각 웰이 여러 1차 항체를 가질 수 있습니다.

큐베이팅하여 샘플 항체 이소형이 각 면역비드에 포획된 특정 항원에 부착될 수 있도록 합니다. 결합되지 않은 1차 항체를 제거하기 위해 분석 완충액으로 세척합니다. 1차 항체의 각 변이체에 해당하는 형광 염료 태그 2차 항체를 웰에 추가합니다.

표지된 각 2차 항체는 각각의 1차 항체의 Fc 부위에 결합합니다. 여러 개의 비드 포획 항원-1차 항체 복합체는 형광 표지됩니다. 플레이트를 세척하여 결합되지 않은 2차 항체를 제거합니다.

각각의 파장에서 서로 다른 형광단을 동시에 검출할 수 있는 형광 분석기를 사용하여 플레이트를 판독합니다. 신호 검출에 따라 혈청 항체의 다양한 이소형과 다양한 항원과의 결합을 평가할 수 있습니다.

분석 성능을 위해 결합 된 마이크로 스피어를 30 초 동안 와류에 의해 재현탁하고 60-90 초 동안 초음파 처리합니다. 그런 다음 각 튜브에서 필요한 양의 각 비드 콜로이드를 제거하고 비드 콜로이드를 새로운 1.5mm 미세 원심분리기 튜브에 결합합니다.

그런 다음 튜브를 자기 분리기에 삽입하고 60초 동안 분리합니다. 튜브가 여전히 자기 분리기에 있는 상태에서 비드 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 제거합니다.

분리기에서 비드를 제거한 후 비드를 100마이크로리터의 분석 완충액에 재현탁합니다. 30초 동안 소용돌이치다가 튜브를 자기 분리기에 60초 동안 넣어 비드를 분리합니다. 세탁을 두 번 반복합니다.

다음으로, 각 표적에 대해 1μL당 100개의 마이크로스피어의 최종 농도를 생성하기 위해 적절한 부피의 분석 완충액을 추가하여 3-플렉스 작동 마이크로스피어 혼합물의 농도를 조정합니다.

스피어 혼합물 25마이크로리터를 96웰 플레이트의 각 웰에 분취합니다. 혈장 또는 혈청 검체를 분석 완충액에서 500배 희석하고 원하는 적정에 따라 표준 검체를 준비합니다.

25마이크로리터의 분석 완충액을 블랭크 샘플로 추가하고 희석된 검체 또는 표준물질 각각을 96웰 검체 플레이트의 각 지정된 웰에 추가합니다. 완료되면 플레이트를 알루미늄 씰 또는 호일로 덮어 분당 700회전으로 설정된 플레이트 셰이커에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

원고에 설명된 대로 분석 완충액과 함께 4 μg/mL의 항인간 검출 항체 용액 또는 2차 항체 용액을 준비합니다. 플레이트를 자기 분리기 위에 올려 빠르게 세척한 다음 생물학적 위험 용기 위로 플레이트를 강제로 뒤집어 웰에서 액체를 제거합니다. 접시를 거꾸로 한 상태에서 두꺼운 종이 뭉치에 접시를 세게 두드립니다.

그런 다음 각 웰을 100마이크로리터의 분석 완충액으로 세척하고 생물학적 위험 용기 위에서 강제로 반전시켜 액체를 제거합니다. 세탁을 두 번 반복합니다. 마지막 세탁 후에는 사용한 종이 뭉치를 모두 생물학적 위험 용기에 버립니다.

다음으로, 96웰 플레이트의 각 웰에 25마이크로리터의 2차 항체 작동 용액을 추가하고 플레이트를 알루미늄 호일로 덮어 플레이트 셰이커에서 분당 700회전으로 배양합니다.

배양 30분 후, 앞서 설명한 것처럼 플레이트의 웰을 분석 완충액으로 두 번 세척합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 분석 완충액을 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 실온의 플레이트 셰이커에서 5분 동안 배양합니다.

시스템 설명서에 따라 기기 분석기를 통해 60마이크로리터 샘플을 분석합니다.