Phospholipase Activity Assay: Anthopleura dowii 의 조독 추출물에서 Phospholipase 활성을 결정하기 위한 겔 확산 분석

0 조회수3:16 • July 8th, 2025

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인지질은 인산염기를 포함하는 복합 지질입니다. 이 분자는 포스포리파아제라는 효소에 의해 가수분해됩니다.

포스포리파제 활성 분석을 수행하려면 효소의 기질 역할을 하는 인지질이 풍부한 달걀 노른자 에멀젼을 섭취하십시오. 염화나트륨이 함유된 따뜻한 아가로스 용액에 노른자를 첨가하면 후속 단계에서 노른자 단백질의 안정성이 향상됩니다.

혼합물에 염화칼슘과 형광 염료인 로다민을 보충하십시오. 혼합물을 페트리 플레이트에 붓습니다. 응고 시 노른자 인지질은 아가로스 겔 매트릭스에 균질하게 분포된 상태로 유지됩니다.

튜브를 사용하여 젤에 적절한 거리의 웰을 만듭니다. 다양한 농도의 포스포리파아제를 함유한 조단백질 추출물을 웰에 첨가합니다. 플레이트를 생리학적 온도에서 배양합니다.

추출물의 포스포리파아제는 겔 속으로 방사형으로 확산됩니다. 겔의 칼슘 이온은 포스포리파아제에 결합하여 효소를 활성화합니다. 이 효소는 인지질을 절단하여 유리 지방산을 생성합니다. 겔의 로다민 분자는 방출된 지방산과 복합체를 형성합니다.

자외선으로 조명을 비추면 우물 주위에 형광 후광이 나타나는 것을 관찰하십시오. 후광은 효소 활성의 존재를 확인합니다. 포스포리파아제 농도가 높을수록 효소 분자가 더 확산되어 후광의 직경이 증가합니다.

고기 달걀 1개를 증류수에 1% SDS로 씻고 멸균 상태에서 달걀 흰자에서 달걀 노른자를 분리합니다.

용액 A, B, C, D를 준비합니다. 용액 B에 용액 A와 C 500마이크로리터를, 용액 D 100마이크로리터를 넣고 섞어서 각 페트리 접시에 25밀리리터를 붓습니다. 멸균 상태에서 용액이 응고될 때까지 기다렸다가 얇은 튜브로 직경 약 2-3mm의 우물을 만듭니다.

한 웰에 음성 대조군으로 총 20마이크로리터의 인산염 완충액을 추가하고, 다른 웰에 양성 대조군으로 결정된 포스포리파아제 20마이크로리터를 추가합니다.

나머지 웰에 5, 15, 25, 35 및 45마이크로그램의 조추출물 단백질을 각각 20마이크로리터의 최종 부피로 넣습니다. 섭씨 37도에서 20시간 동안 배양합니다.

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마지막 업데이트: 15 8월 2026