고리 모양의 미세패터닝 세포 키랄성 분석: 고리 모양의 미세패턴에서 세포 정렬을 기반으로 다세포 키랄성을 결정하는 시험관 내 기술

시험관 내 포유류 세포 키랄성(제한된 조건에서 왼쪽 또는 오른쪽 방향으로 정렬되는 세포의 좌우 편향)을 결정하려면 배지 함유 멀티웰 플레이트에서 맞춤형 제작된 금 코팅 슬라이드로 시작합니다. 슬라이드는 세포 접착 촉진 피브로넥틴의 고리 모양 섬의 마이크로 패턴으로 구성되며, 세포 접착 저항성 자체 조립 단층으로 다시 채워져 있습니다.

다음으로, 적절한 양의 포유류 세포 현탁액을 슬라이드에 시드하고 배양합니다. 세포는 피브로넥틴 함유 고리 마이크로패턴에 흡착됩니다. 주변의 자체 조립 단층은 링 경계 외부의 비특이적 셀 부착을 방지합니다.

매체를 새 매체로 교체하고 부착되지 않은 셀을 제거합니다. 액틴 간섭 약물을 한 세트의 슬라이드에 추가하고 배양합니다.

부착된 세포는 증식하여 퍼지고 밑에 있는 피브로넥틴 섬의 모양을 취하는 동시에 세포 단층을 제한하여 편향된 정렬을 촉진하는 공간적 단서에 반응하여 액틴 섬유를 재구성합니다.

이제 세포 고정을 위해 슬라이드를 파라포름알데히드로 처리합니다. 위상차 현미경에서 링 마이크로패턴의 세포는 우선 편향에 따라 정렬된 밝은 윤곽을 가진 어두운 영역으로 나타납니다.

소프트웨어를 사용하여 각 셀의 정렬 각도를 링의 원주 방향으로부터의 편차로 계산합니다. 포유류 세포 키랄성을 결정하기 위한 평균. 액틴 간섭 약물 처리 세포는 역키랄성을 나타낼 수 있습니다.

세포를 파종하기 전에 섭씨 37도에서 템퍼링된 수조에서 배지와 트립신을 데웁니다.

더 나은 세포 부착을 위해 패턴이 있는 슬라이드를 배양 배지가 들어 있는 12웰 플레이트에 담그고 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 따뜻하게 합니다. 세포가 트립신화되면 FBS 함유 배지로 세포를 중화합니다. 세포를 100 x g으로 3분 동안 펠릿으로 내린 다음 세포 펠릿을 신선한 배지에 재현탁합니다. 세포를 계산하고 세포 현탁액을 희석하여 밀리리터당 200,000개 세포의 농도를 달성합니다.

1개의 금 슬라이드를 포함하는 각 웰에 0.5밀리리터의 세포 현탁액을 첨가합니다. 균일한 세포 파종을 위해 플레이트를 몇 번 부드럽게 흔든 후 세포 부착을 위해 15분 동안 배양합니다. 15분 후 현미경으로 세포 부착을 확인하고 필요한 경우 잠시 더 배양합니다.

세포가 부착되면 각 웰에서 부착되지 않은 세포가 포함된 배지를 흡인하고 신선한 배양 배지 1밀리리터를 추가합니다. 인큐베이터에서 24시간 동안 세포를 배양하고 융합성을 확인하여 키랄성이 형성되었는지 확인합니다.

필요한 컨플루션이 달성되면 배양 배지를 제거하여 세포를 고정합니다. PBS로 한 번 헹군 후 슬라이드에 4% 파라포름알데히드 용액을 첨가하고 실온에서 15분 동안 배양한 후 PBS로 다시 3회 헹굽니다.

이미지를 획득하려면 카메라 기능이 있는 위상차 현미경을 사용하고 슬라이드의 각 링을 고해상도로 캡처합니다.

키랄성 특성화를 위해 MATLAB 코드 파일을 다운로드하십시오. 코드 폴더와 하위 폴더를 MATLAB 경로에 추가하고 "ROI_selection.m" 파일을 엽니다. 4행에서 디렉토리를 원하는 데이터 폴더로 변경합니다.

14행의 이미지 크기를 변경하여 처음 두 그림은 링의 내부 원 크기를 나타내고 나머지 두 그림은 바깥쪽을 나타냅니다.

위상차 이미지에서 관심 영역 또는 ROI를 확인하려면 실행 버튼을 클릭하여 MATLAB 코드 "ROI_selection.m" m을 실행합니다. 선택 사각형을 링에 맞게 수동으로 드래그한 다음 이미지를 두 번 클릭하여 선택을 확인합니다.

폴더의 모든 이미지에서 ROI를 선택하면 각 이미지에 대한 ROI 정보를 저장하기 위해 ".mat" 파일이 생성됩니다. 그런 다음 "Analysis_batch.m" 파일을 열고 앞에서 설명한 대로 폴더의 디렉토리를 변경합니다. 실행 버튼을 클릭하여 코드 "Analysis_batch.m"을 실행하여 여러 셀룰러 링 패턴의 키랄성을 결정합니다.

각 링에 대한 순환 통계와 시계 방향, 비키랄 및 시계 반대 방향 링의 수를 포함하는 "datatoexcel.txt" 파일이 생성됩니다.