Extracellular Vesicle Uptake Assay: 3D 형광 이미징 기법을 사용하여 세포외 소포의 세포 흡수를 시각화하고 정량화하는 방법

세포 통신을 촉진하기 위해 세포는 세포외 소포인 EV(지질막으로 둘러싸인 나노 크기 구조)를 분비합니다. EV는 거대분자와 대사산물을 포함한 다양한 생물학적 화물을 수용 세포에 전달합니다

공초점 현미경을 사용하여 세포에 의한 EV 흡수를 시각화하려면 먼저 새로 분리된 EV를 채취합니다. 이러한 EV는 형광 프로브에 결합된 항체로 사전 라벨링되어 있어 이후에 쉽게 시각화

적절한 양의 형광 표지된 EV를 부착 수용자 세포 배양에 추가합니다. 원하는 기간 동안 배양합니다. 배양하는 동안 표지된 EV의 하위 집단은 세포 표면에 표면적으로 부착되는 반면 다른 EV는 내재화됩니다.

다른 형광 염료를 추가하여 세포 세포질을 표지하여 내재화된 EV와 수용 세포에 부착된 EV를 구별하는 데 도움이 됩니다. 세포를 공초점 현미경 아래에 놓고 z축을 따라 서로 다른 초점면에서 이미지를 촬영하여 샘플 두께에 걸쳐 일련의 광학 단면을 획득합니다.

이 광학 섹션 모음(z-스택)을 컴파일하여 고해상도 3차원 샘플 이미지를 형성합니다. 가상 렌더링(포스트 이미징 프로세스)을 적용하여 셀 표면을 재구성합니다.

표면적으로 접착된 EV와 내재화된 EV를 구별하려면 서로 다른 색상의 점으로 렌더링합니다. 세포 부피와 내부화된 EV 수를 계산하여 세포당 EV 흡수를 정량화합니다.

4 x 10⁴ PC3 세포를 1밀리리터 배지가 있는 35밀리리터 접시에 시드합니다. 세포가 최적의 세포 배양 조건에서 밤새 부착되도록 합니다. 다음날, 부착된 세포를 엑소좀 고갈 배지로 두 번 세척합니다.

엑소좀 고갈 배지를 사용하여 형광 표지된 EV를 적절한 농도로 희석한 후, 희석된 EV를 부착된 표적 세포에 첨가하고 원하는 실험 시간 동안 배양합니다. 엑소좀이 없는 배지로 세포를 세 번 세척하여 내재화되지 않은 EV를 제거한 후, 부착된 세포의 세포질을 1μg/mL의 CMTMR로 표지하고 최적의 세포 배양 조건에서 배양합니다.

살아있는 세포 이미징의 경우 준비된 세포를 스테이지 인큐베이터에 넣습니다. 대조군 샘플을 기반으로 이미징 매개변수를 설정한 후 표적 세포의 깊이와 z 방향의 스태킹 크기 범위를 결정하여 3D 공초점 이미지를 획득합니다. 그런 다음 이미지 획득을 세포 특이적 염료와 EV 특이적 염료의 여러 z-스택 이미지로 동시에 설정합니다.

이미지 처리를 위해서는 자동 이미지 처리 소프트웨어를 활용하십시오.

셀의 가상 표면을 구축하려면 '새 표면 추가'를 클릭합니다. 가상 셀 표면을 구성하려면 '+ 추가' 버튼을 클릭하고 '필터 유형'으로 '품질'을 선택합니다. 육안 검사로 하한의 적절한 값을 임계값으로 설정하고, 상한의 최대값을 설정한 후 '마침' 버튼을 클릭합니다.

다음으로 EV의 가상 점을 만들려면 '새 지점 추가' 버튼을 클릭합니다. "알고리즘 설정"에서 '다른 스폿 크기'와 '최단 거리 계산'을 선택합니다. 그런 다음 '다음'을 클릭하고 "채널 1 - Alexa Fluor 488"을 "소스 채널"로 선택합니다. "스폿 감지" 아래에 '예상 XY 직경'에 적절한 값을 입력하고 '다음'을 클릭합니다.

가상 EV 도트를 구성하려면 '+ 추가' 버튼을 클릭하고 '필터 유형'으로 '품질'을 선택합니다. 육안 검사로 "하한 임계값"을 설정하고 '다음'을 클릭합니다. "스팟 영역 유형"에서 '절대 강도'를 선택한 후 '다음'을 클릭합니다.

EV 도트 영역의 임계값을 지정하려면 육안 검사를 통해 "영역 임계값"에 적절한 값을 입력합니다. "Region Volume"에서 "Diameter from"을 선택하고 'Finish'를 클릭합니다.

빌드 표면 내에서 그룹화된 스팟을 분할하려면 빌드된 '스팟'을 클릭하고 '필터'로 이동합니다. 그런 다음 '추가' 버튼을 클릭하고 '표면까지의 최단 거리 표면 = 표면 1'을 "필터 유형"으로 선택합니다.

하한의 최저 임계값과 상한의 적절한 값을 설정한 후 '새 스팟에 섹션 복제' 버튼을 클릭합니다.

셀 내부의 EV를 자동으로 계산하려면 구축된 '스팟 1 선택'을 클릭하고 '통계'로 이동하여 '총 스팟 수'에서 값을 내보냅니다.

셀 수를 얻으려면 구축된 '표면 1'을 클릭한 다음 '통계'로 이동하여 '전체'에서 "총 표면 수" 값을 내보냅니다. 마지막으로 '통계' 아래의 '세부 정보' 탭으로 이동하여 볼륨을 내보냅니다.