JoVE 실험 백과사전
생물학적 기술
0 조회수 • 3:44 분 • July 8th, 2025
미토콘드리아 내에서 미토콘드리아 내부 막의 매트릭스에 국한된 구연산염 합성효소는 아세틸 코엔자임 A와 옥살로아세트산 사이의 반응을 촉매하여 구연산 회로의 첫 번째 단계인 구연산염을 형성하는 속도 제한 효소입니다.
구연산염 합성효소 활성을 분석하려면 미토콘드리아에 풍부한 성체 초파리 파리 흉부를 에틸렌디아민테트라아세트산, EDTA 및 비이온성 세제가 포함된 냉각 추출 완충액으로 채워진 튜브로 옮깁니다.
열에 의한 단백질 변성을 방지하기 위해 얼음 위에서 흉부 조직을 균질화합니다. 세제와 함께 가해진 전단력은 조직을 용해시키고 미토콘드리아를 포함한 세포내 성분을 방출합니다.
또한, 내부 미토콘드리아 막의 파열은 구연산염 합성효소를 포함한 미토콘드리아 기질 단백질의 방출로 이어집니다. EDTA는 2가 양이온에 결합하고 프로테아제 활성을 억제하여 단백질 분해를 방지합니다.
추출 완충액을 사용하여 균질염을 희석하고 멀티웰 플레이트의 웰을 포함하는 반응 혼합물에 적절한 부피를 추가합니다. 반응 혼합물은 아세틸 코엔자임 A, 옥살로아세트산 및 디티오니트로벤조산을 포함한다.
균질산염의 구연산염 합성효소는 옥살로아세트산과 아세틸 조효소 A 사이의 반응을 촉매하여 구연산염과 조효소 A를 티올기로 형성합니다. 티올기는 무색 디티오니트로벤조산과 반응하여 노란색 생성물인 티오니트로벤조산을 형성합니다.
마이크로플레이트 리더를 사용하여 노란색 용액의 흡광도를 측정합니다. 흡광도는 조직 균질의 구연산염 합성효소 활성과 관련이 있을 수 있습니다.
성체 파리 흉부 10마리를 즉시 100마이크로리터의 얼음처럼 차가운 추출 완충액에 옮기고 얼음 위에 유봉으로 균질화합니다. 얼음 위에서 5-10초 동안 균질화하여 샘플을 차갑게 유지하고 얼음 위에 5초 동안 그대로 둔 다음 모든 조직이 완전히 균질화될 때까지 반복합니다.
단백질 함량 측정을 위해 균질화된 각 샘플의 10마이크로리터를 새 튜브에 분취하고 이 튜브도 얼음 위에 보관합니다. 총 500마이크로리터의 남은 샘플에 400마이크로리터의 얼음처럼 차가운 추출 완충액을 추가하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다.
각 반응에 대해 1마이크로리터의 희석된 세포 용해물을 150마이크로리터의 새로 준비된 반응 용액에 첨가합니다. 기포가 생기지 않도록 부드럽게 피펫팅하여 완전히 혼합하십시오. 그런 다음 플레이트 리더를 사용하여 섭씨 25도에서 4분 동안 10-30초마다 412나노미터의 흡광도를 측정합니다.
시간 경과에 따른 흡광도로 데이터를 플로팅한 다음 곡선의 선형 부분에 대한 기울기를 계산합니다. 마지막으로, 반응 속도 또는 기울기를 샘플 단백질 농도로 나누어 구연산염 합성효소 활성을 정상화합니다.