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생물학적 기술
0 조회수 • 3:03 분 • July 8th, 2025
조직에서 다양한 대사 과정에 중요한 필수 미네랄인 철분은 일반적으로 혈단백질과 비헴철 단백질에 격리되어 존재합니다. 혈단백은 포르피린 고리에 결합된 철 또는 헴철을 포함하는 반면, 비헴철 단백질은 포르피린 고리 구조가 부족하고 대부분 철 또는 비헴철을 포함합니다.
마우스 간 조직에서 비헴철 함량을 추정하기 위해, 건조되고 수확된 마우스 간 조직 단편을 저농도의 염산과 트리클로로아세트산으로 처리한다. 고온에서 배양하여 조직을 소화하고 산으로 유도된 단백질 침전을 촉진합니다.
낮은 산 농도로 인해 비헴철이 관련 단백질에서 방출됩니다. 포르피린 고리에 결합된 헴철은 영향을 받지 않습니다.
냉각 후, 비헴철을 함유한 원하는 부피의 상청액을 멀티웰 플레이트로 옮깁니다. 환원제인 티오글리콜산을 보충한 발색성 철-킬레이트제, 바토페난트롤린 설포네이트, BPS를 적절한 완충액에 첨가하고 배양합니다.
티오글리콜산은 모든 비철 비헴철을 제일철로 환원시켜 BPS에 1:3 비율로 쉽게 결합하여 매우 안정적인 분홍색 복합체를 형성합니다. 또한 티오글리콜산은 BPS와 상호 작용할 수 있는 구리와 같은 오염된 2가 금속 양이온으로 인한 간섭을 방지합니다.
멀티웰 플레이트를 마이크로플레이트 리더기에 넣어 마우스 간 조직 단편에서 비헴철 농도를 대표하는 분홍색 철-BPS 복합체의 흡광도를 측정합니다.
건조된 각 조직 조각을 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 1밀리리터의 산 혼합물을 튜브에 넣고 닫습니다. 여기에서 조직이 생략된 것을 제외하고는 같은 방법으로 산성 블랭크를 준비합니다.
튜브를 섭씨 65도에서 20시간 동안 배양하여 조직을 소화합니다.
실온으로 냉각한 후 플라스틱 팁이 장착된 마이크로피펫을 사용하여 500마이크로리터의 투명산 추출물을 새로운 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮깁니다.
평평한 바닥, 96웰, 투명, 처리되지 않은 폴리스티렌 마이크로플레이트에 직접 발색원 반응을 준비합니다. 실온에서 15분 동안 배양합니다.
탈이온수 기준에 대해 535나노미터 파장의 플레이트 리더에서 샘플 흡광도를 측정합니다.
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