Resorption Pit Assay: Calcium Phosphate-Coated Culture Plate를 사용하여 성숙한 골세포의 칼슘 흡수 활성을 정량화하는 In Vitro 기술

다핵 대식세포인 파골세포는 뼈 흡수를 촉진하여 뼈 조직의 분해 및 뼈 미네랄의 방출을 촉진합니다.

시험관 내에서 파골세포 흡수를 정량화하기 위해, 파골세포 전구 세포 및 부착을 위한 배지를 포함하는 대식세포 콜로니 자극 인자인 M-CSF에서 인간 말초 혈액 단핵 세포를 배양합니다. 파골세포 전구세포를 수확하고 원심분리합니다.

M-CSF 및 핵 인자 카파-Β 리간드의 수용체 활성화제인 RANKL이 보충된 배지에 재현탁된 세포 현탁액을 무기 뼈 성분을 모방하여 인산칼슘으로 코팅된 멀티웰 플레이트 웰에 피펫팅합니다. M-CSF와 RANKL은 파골세포 전구세포 분화 및 파골세포로의 융합을 일으켜 흡수를 활성화합니다.

활성화된 파골세포는 인산칼슘 코팅에 부착되어 세포골격을 재구성하여 액틴이 풍부한 밀봉 영역을 형성하고 양성자와 산성 가수분해효소를 분비하는 주름진 경계를 개발합니다. 생성된 산성 환경은 인산칼슘 코팅을 용해시켜 칼슘과 인산염 이온을 방출하고 흡수 구덩이를 형성합니다.

배양 후 우물을 세척하여 용해된 이온을 제거합니다. 후속 염색을 위해 파골세포를 고정하고 투과시킵니다. 액틴 필라멘트를 적절한 염료로 염색하십시오. DNA 결합 염료로 핵을 대조염색합니다. 칼슘 결합 염료로 웰 코팅의 칼슘을 염색합니다.

형광 현미경에서 기능성 파골세포는 흡수 기능에 중요한 여러 형광 핵과 액틴 고리를 나타냅니다. 흡수 구덩이는 액틴 고리에 의해 겹쳐진 형광 인산칼슘 코팅에 검은색 영역으로 나타납니다.

적절한 소프트웨어를 사용하여 구덩이 면적을 정량화하여 파골세포 흡수를 결정합니다.

20ng/mL 대식세포 콜로니 자극 인자를 포함하는 완전한 알파-MEM에 PBMC를 재현탁하고 플라스크에 2.5 x 10⁵ 세포/cm² PBMC를 시드합니다. 인산칼슘으로 코팅된 플레이트를 섭씨 37도에서 50마이크로리터의 소태아 혈청과 함께 1시간 동안 배양합니다.

다음으로, 플라스크를 PBS로 두 번 세척하여 죽은 세포 또는 비부착 세포에서 파골세포 전구체를 분리합니다. 그런 다음 75cm²플라스크당 4밀리리터의 트립신을 추가합니다. 30분 후 4밀리리터의 완전 알파-MEM을 첨가하여 소화를 중단합니다. 그런 다음 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 조심스럽게 분리합니다.

세포를 50밀리리터 튜브로 옮기고 계수 챔버를 사용하여 총 세포 수를 계산합니다. 튜브를 350 x g에서 7분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화하고 펠릿을 M-CSF 및 RANKL을 포함하는 완전한 알파-MEM에 재현탁하여 1 x 10⁶ cells/mL를 얻습니다.

인산칼슘 코팅 플레이트에서 소 태아 혈청을 흡인하고 웰당 200마이크로리터의 세포 현탁액을 피펫으로 삽입합니다. 배양 후, PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 세포를 4% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정한 후 PBS로 다시 세척합니다.

염색을 위해 고정 세포에 투과화 완충액을 첨가하고 5분 동안 배양합니다.

액틴 필라멘트를 염색하려면 PBS에서 100마이크로리터의 AlexaFluor 546 표지 팔로이딘 용액과 함께 세포를 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 염색 용액을 흡인하고 100마이크로리터의 Hoechst를 사용하여 핵을 10분 동안 염색합니다.

산칼슘 코팅을 100마이크로리터의 10마이크로몰 칼세인으로 PBS에 10분 동안 염색합니다. PBS로 세 번 세척한 후 이미지를 캡처합니다.