단백질 인산화 분석을 위한 Single-molecule pull-down assay: 세포 용해물에서 단백질 인산화를 정량화하기 위한 고처리량 기법

특정 세포 단백질의 인산화는 생물학적 기능에 중요합니다.

단일 분자 풀다운 분석을 사용하여 온전한 단백질의 인산화 수준을 정량화하려면 그리드 어레이 패턴이 있는 유리 커버슬립을 가져가는 것부터 시작합니다. 각 구획은 단백질 결합 중 입체 장애를 방지하기 위해 일반 PEG와 간격을 둔 비오티닐화 폴리에틸렌 글리콜 또는 PEG 기반 링커로 코팅됩니다.

커버슬립을 환원 시약으로 처리하여 분석에서 자가형광을 최소화합니다. 커버슬립에 뉴트라비딘(비오틴 결합 단백질)을 오버레이하고 배양하여 비오티닐화된 PEG 링커에 결합할 수 있도록 합니다.

특정 항표적 단백질 항체로 어레이를 보완합니다. 각 항체에는 Fc 영역에 연결된 비오틴이 포함되어 있어 항체를 뉴트라비딘에 고정시켜 고정을 유발합니다.

이제 표적 단백질의 녹색 형광 태그가 있는 인산화 및 비인산화 변이체를 포함하여 다양한 단백질을 포함하는 세포 배양 용해물을 추가하고 배양합니다. 표적 단백질의 두 변이체 모두 항체에 의해 포획되어 복합체를 형성합니다. 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위해 세척하십시오.

다음으로, 이러한 복합체를 단백질의 인산화 잔기에만 결합하여 복합체에 다른 형광 신호를 부여하는 두 번째 적색 형광 태그 항체 세트로 처리합니다.

형광 현미경으로 어레이를 이미지화하고 두 가지 별개의 형광 신호를 관찰합니다. 두 형광 신호의 공동 국소화는 샘플에 인산화 된 단백질의 존재를 나타냅니다.

냉동실에서 비오틴-PEG 기능화 어레이를 제거하고 실온으로 평형을 유지합니다. 밀봉 필름이 늘어선 100mm 조직 배양 접시 위에 어레이가 위를 향하도록 커버슬립을 놓습니다. 어레이의 각 사각형을 수소화붕소나트륨 및 PBS의 밀리리터당 10mg과 함께 실온에서 4분 동안 배양합니다. PBS로 세 번 세척합니다.

다음으로, T50에서 밀리리터당 0.2mg의 NeutrAvidin과 함께 5분 동안 배양한 다음 T50-BSA로 세 번 세척합니다. T50-BSA에서 비오티닐화된 POI 특이적 항체 밀리리터당 2마이크로그램으로 10분 동안 배양한 후 세척합니다.

먼저 피펫팅으로 용해물을 해동하고 혼합합니다. 용해물 1마이크로리터를 얼음처럼 차가운 T50-BSA/PPI 100마이크로리터로 희석합니다. 어레이에서 용해물을 10분 동안 배양한 후 세척합니다. 얼음처럼 차가운 T50-BSA/PPI에서 AF647 접합 항-포스포티로신 항체를 준비하고 어레이에서 1시간 동안 배양합니다.

대물렌즈에 기름 한 방울을 떨어뜨립니다. 이미징을 위해 나노그리드를 스테이지에 놓습니다. 투과된 백색광을 사용하여 그리드 패턴에 초점을 맞춥니다. 그리드의 20개 이미지 시리즈를 획득합니다. 픽셀이 포화되지 않았는지 확인하고 이미지 시리즈를 "기준"으로 저장합니다.

나노 그리드의 초점을 디하여 에어리 패턴을 만듭니다. 게인 보정을 위해 일련의 20개 이미지를 수집하고 이미지를 "게인"으로 저장합니다. 그런 다음 카메라에 가해지는 모든 빛을 차단하여 카메라 오프셋을 위해 일련의 20개의 이미지를 획득하고 이미지를 "배경"으로 저장합니다.

SiMPull 이미지를 얻으려면 먼저 오일 대물렌즈를 청소하고 대물렌즈에 추가 오일을 넣으십시오. 현미경 스테이지에 커버슬립 어레이를 고정합니다. 각 샘플에 대한 이미지를 먼저 원적외선 채널에서 획득한 다음 더 낮은 파장 형광단에서 획득합니다. 30-45분마다 완충액을 확인하고 필요에 따라 보충하십시오.