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생물학적 기술
0 조회수 • 4:02 분 • July 8th, 2025
셉틴은 곡선형 원형질막 표면에 결합하는 주요 세포골격 단백질입니다.
마이크로스피어에서 시험관 내 셉틴 조립을 관찰하려면 먼저 이중층 형성을 위한 견고한 지지체 역할을 하는 균일한 크기의 미세한 실리카 비드의 현탁액을 취합니다. 이 서스펜션을 소용돌이쳐 비드 클러스터를 부수십시오.
작은 단층 소포, SUV - 단일 지질 이중층으로 둘러싸인 구형 소포로 보완하십시오. 마이크로스피어가 침전되는 것을 방지하면서 지속적으로 교반하면서 배양합니다.
배양하는 동안 외부 극성 헤드 그룹은 친수성 마이크로스피어 표면에 SUV의 흡착을 촉진합니다. 이러한 상호 작용으로 인해 SUV가 파열되고 SUV 지질이 곡선 마이크로스피어 표면에 연속층으로 융합되어 구형의 지지된 지질 이중층(SLB)이 형성됩니다.
세척하여 과도한 결합되지 않은 지질을 제거하고 반응 완충액에 재현탁합니다. 비특이적 흡착을 방지하기 위해 구형 SLB 현탁액을 폴리에틸렌 글리콜 코팅 표면의 작은 영역으로 옮깁니다. 형광 표지된 셉틴 현탁액을 챔버에 추가하고 배양합니다.
셉틴은 구형 SLB의 양의 곡률을 인식하는 이종 올리고머를 형성하고 중합되어 필라멘트를 형성합니다. 결국 셉틴 필라멘트는 서로 상호 작용하여 고차 구조를 형성합니다.
고해상도 형광 현미경으로 셉틴 코팅된 SLB를 관찰합니다. 형광의 존재는 셉틴의 곡률에 민감한 증착을 나타냅니다.
먼저 실리카 마이크로스피어가 들어 있는 병을 15초 동안 소용돌이치게 합니다. 그런 다음 1 분 동안 목욕 초음파 처리하고 다시 15 초 동안 소용돌이치어 클러스터를 부수십시오. 비드를 SLBB 및 10마이크로리터의 5밀리몰 SUV와 혼합하여 접착력이 낮은 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다.
침전을 방지하기 위해 셰이커에서 실온에서 1시간 동안 비드-지질 혼합물을 배양합니다. 그 동안 PEG화된 커버슬립을 해동하고 절단된 0.2밀리리터 PCR 튜브를 붙입니다. 배양 후, 지정된 RCF에서 30초 동안 비드를 원심분리합니다.
첫 번째 탈수 후 50마이크로리터의 상층액을 제거합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 PRB를 추가하고 세게 피펫팅하여 혼합합니다. 다음 라운드에서는 200마이크로리터의 PRB를 제거하고 두 번째와 세 번째 스핀 후에 200마이크로리터를 더 추가하고, 네 번째 스핀 후에 220마이크로리터의 PRB를 추가합니다.
여러 비드 크기로 경쟁 분석을 수행하는 경우 각 비드 크기를 동일한 부피로 혼합하고 이 비드 혼합물 29마이크로리터를 721마이크로리터의 반응 완충액으로 희석하여 반응을 준비합니다. 그런 다음 희석된 비드 75마이크로리터와 SSB에 희석된 단백질 25마이크로리터를 웰에 넣고 혼합합니다.
정상 상태에서 셉틴을 측정하는 경우 혼합물을 실온에서 1시간 동안 배양한 다음 TIRF에 가까운 현미경 또는 공초점 현미경으로 이미지를 촬영합니다.