In vitro mineralization assay: Alizarin Red S 염색 및 추출에 의한 뼈 이식 대체체의 골아세포 칼슘 침전물을 정량화하는 비색 방법

0 조회수3:57 • July 8th, 2025

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뼈 재생 중에 뼈 형성 세포인 조골세포가 골절 부위로 모집되어 증식하고 콜라겐 기질인 오스테이드를 분비합니다. 성숙 기간이 지나면 조골세포는 칼슘과 인산염 이온의 조절된 침착에 의해 골양을 광물화하여 새로운 뼈 합성을 시작합니다.

시험관 내에서 조골세포 광물화 정도를 정량화하려면 적절한 배지에서 1차 조골세포 현탁액을 얻으십시오. 현탁액을 다공성 뼈 이식 대체 디스크가 포함된 멀티웰 플레이트에 시드하고 배양합니다.

디스크는 세포 접착과 증식을 허용하는 스캐폴드 역할을 합니다.

사용한 배지를 골형성 보충제가 포함된 신선한 배지로 교체하십시오. 장기간 배양하십시오. 골형성 보충제는 조골세포를 자극하여 콜라겐 기질을 생성하고 이후에 광물화합니다.

고정 후 광물화된 매트릭스를 알리자린 레드 S, ARS, 용액으로 염색합니다. 음전하를 띤 염료인 ARS는 매트릭스에서 양전하를 띤 칼슘 이온과 결합하여 적색 복합체를 형성합니다. 여분의 얼룩을 제거하십시오. 조골세포 광물화를 암시하는 빨간색 칼슘 침전물을 감지하기 위해 플레이트를 이미지

화합니다.

다음으로 염화세틸피리디늄, CPC, 용액을 첨가합니다. 미셀라 형태의 양전하를 띤 계면활성제인 CPC는 매트릭스의 칼슘 이온에 결합된 반대 전하를 띤 ARS와 헤드 그룹을 통해 복합체를 형성하여 용액으로의 염료 추출을 용이

하게 합니다.

용액을 수집하고 원심분리합니다. CPC-염료 복합체를 포함하는 상청액을 멀티웰 플레이트로 옮기고 마이크로플레이트 리더를 사용하여 흡광도를 측정합니다.

CPC-염료 복합체의 흡광도는 매트릭스의 칼슘 침전물의 양을 나타내며, 이는 조골세포 광물화 정도의 추정

치입니다.

염색된 베타-인산삼칼슘 디스크를 새 웰로 옮기고 평판 스캐너로 플레이트를 스캔하여 광물화를 기록합니다.

이미지 캡처 후 250마이크로리터의 10% 세틸피리디늄 클로라이드 용액을 넣고 15분 동안 흔들어 알리자린 레드 S 염료를 추출합니다. 다음으로, 용액을 웰에서 개별 1.5밀리리터 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 17,000배 g으로 원심분리합니다.

추출물을 10밀리리터 튜브에 1:10에서 1:20의 희석 비율로 1.5% 세틸피리디늄 클로라이드 용액으로 희석합니다. 그런 다음 희석된 각 샘플 300마이크로리터를 96웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 10% 염화세틸피리디늄만 포함하는 두 개의 빈 웰을 포함합니다.

다음으로, 40밀리몰 알리자린 레드 S 염색 용액을 10% 세틸피리디늄 클로라이드 용액으로 희석하여 4 내지 400마이크로몰 범위의 7가지 알리자린 레드 S 참조 표준물질을 준비하여 표준 곡선을 생성합니다.

각 표준물질 300마이크로리터를 플레이트에 넣습니다. 마지막으로 520나노미터에서 샘플, 블랭크 및 참조 표준의 흡광도를 읽습니다.

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마지막 업데이트: 1 8월 2026