0 조회수 • 4:08 분 • July 8th, 2025
혈관신생은 발달 및 병리학적 상태에서 기존 혈관에서 새로운 혈관이 형성되는 것입니다. 혈관 내부 표면을 감싸고 있는 내피 세포와 주변 주위 세포(혈관 바깥쪽의 지지 세포) 사이의 광범위한 통신은 혈관신생에 매우 중요합니다.
시험관 내 혈관신생을 연구하려면 피브린 전구체 역할을 하는 가용성 당단백질인 피브리노겐 용액에 현탁된 내피 세포와 주위 세포로 코팅된 마이크로캐리어 비드로 시작합니다.
이제 비드 현탁액을 단백질 분해 효소인 트롬빈 용액이 들어 있는 배양 플레이트에 피펫팅하고 배양합니다. 트롬빈은 피브리노겐 분자에 결합하여 절단되어 불용성 피브린 단량체를 형성하여 고분자 피브린 겔을 형성합니다. 이 단계는 피브린 겔에 세포 코팅된 비드가 포매되도록 합니다.
다음으로, 섬유아세포(결합 조직 전구체 세포)의 배양물을 피브린 겔 위에 플레이트하고 섬유아세포가 활성화될 수 있도록 배양합니다.
배양하는 동안 섬유아세포는 내피 세포 활성화를 유발하는 중요한 혈관신생 성장 인자를 분비합니다. 결합하여 부착된 주위 세포와 내피 세포는 피브린 겔에서 내피 세포가 발아하는 데 도움이 되는 신호 분자를 분비합니다.
내피 새싹은 주위 세포로 감싸인 길쭉한 세포 돌출부로 나타나 혈관신생의 초기 단계를 나타냅니다.
마이크로캐리어 코팅 비드의 접시를 현미경으로 20배 배율로 검사하여 모든 비드가 내피 세포에 의해 충분히 코팅되었는지 확인합니다.
플레이트를 층류 후드로 옮기고 P1000 피펫을 사용하여 코팅된 비드 용액을 격렬하게 흡인 및 분배하여 플레이트 바닥에서 세포를 분리하고 상청액을 개별 튜브로 옮깁니다.
구슬이 튜브 바닥에 3분 동안 가라앉도록 합니다. 그런 다음 P1000 피펫을 사용하여 비드 클러스터를 방해하지 않고 가능한 한 많은 상청액을 제거합니다. 튜브당 1밀리리터의 완전 배지에 비드를 재현탁하고 비드가 30-60초 동안 가라앉도록 합니다. P1000 피펫을 사용하여 상청액을 다시 흡인하고 방금 시연한 대로 신선한 완전 배지로 비드 현탁액에서 자유 부유 내피 세포를 두 번 더 세척합니다.
세 번째 세척 후 비드를 2.5밀리리터의 피브리노겐 용액에 재현탁합니다. 24웰 유리 바닥판에 웰당 13마이크로리터의 트롬빈 용액을 추가합니다. 그런 다음 각 웰에 0.5밀리리터의 비드/피브리노겐 용액을 첨가하고, 비드를 트롬빈에 직접 조심스럽게 피펫팅하고, 천천히 위아래로 2-3회 피펫팅하여 용액을 완전히 혼합합니다.
모든 웰이 시드되면 트롬빈-피브리노겐 용액이 실온에서 30분 동안 층류 후드에서 사전 응고되도록 합니다. 배양이 끝나면 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터에 추가로 1.5-2시간 동안 조심스럽게 옮깁니다.
겔이 완전히 응고되면 정상 인간 폐 섬유아세포를 완전 배지에 밀리리터당 2 x 104 세포 농도로 재현탁하고 각 웰에 1밀리리터의 섬유아세포를 첨가합니다. 그런 다음 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다.