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생물학적 기술
0 조회수 • 3:49 분 • July 8th, 2025
탄수화물 분해 효소는 복잡한 다당류를 더 작은 올리고당으로 분해합니다.
효소 분해 활성을 스크리닝하려면 다양한 색상의 클로로트리아진 염료로 다당류를 염색하여 제조한 다중 발색 고분자 하이드로겔(CPH)을 섭취하는 것부터 시작합니다. 그런 다음 각 다당류는 화학적으로 가교되어 효소 분해를 위한 합성 기질인 하이드로겔을 형성합니다.
이제 다양한 CPH 기질을 다공성 반응판의 별개의 웰에 분배합니다. 활성화 용액을 추가하고 배양하여 기질의 최적 활성화를 보장합니다.
빈 제품 플레이트 위에 분석 플레이트를 놓습니다. 반응판의 기공을 통해 활성화 용액을 효율적으로 제거할 수 있도록 플레이트를 저속으로 함께 원심분리합니다.
다음으로, 효소 활성에 대한 최적의 pH를 유지하는 적절한 완충액에 동일한 유형의 탄수화물 분해 효소로 반응 플레이트의 모든 웰을 보충합니다. 플레이트를 밀봉하고 약한 교반으로 배양하여 효소가 고분자 네트워크에 균일하게 분포되어 기질에 접근할 수 있도록 합니다.
배양하는 동안 기질에 대해 적절한 활성을 가진 효소는 CPH의 다당류를 분해하여 더 작은 염료 결합 올리고당을 생성합니다. 이 생성물은 용해성이므로 용액이 착색됩니다. 플레이트를 돌려 유색 용액을 제품 플레이트에 모으십시오.
분광 광도법으로 효소 활성을 측정하기 위해 제품 흡광도를 결정합니다.
시작하려면 각 웰에 200마이크로리터의 활성화 용액을 추가하여 96웰 필터 분석 키트 플레이트를 활성화합니다. 교반하지 않고 실온에서 10분 동안 배양합니다.
원심분리기와 수집을 위해 표준 96웰 플레이트를 사용하여 현존하는 활성화 용액을 회전시킵니다. 발색성 고분자 하이드로겔 또는 CPH 기판에 100마이크로리터의 멸균수를 추가하고 진공 또는 스핀을 적용하여 안정제를 제거합니다. 세탁을 두 번 더 반복합니다.
효소 반응을 준비하려면 150마이크로리터의 100밀리몰 아세테이트나트륨 완충액 pH 4.5와 세 가지 농도의 엔도셀룰라아제 용액 5마이크로리터를 분석 키트 플레이트의 각 웰에 첨가합니다.
제품 플레이트를 분석 키트 플레이트 아래에 놓아 흔들리는 동안 반응 플레이트에서 누출 가능성을 수집합니다. 그런 다음 분석 키트 플레이트를 실온에서 100RPM의 수평 셰이커에서 30분 동안 배양합니다.
신뢰할 수 있는 데이터를 수신하려면 배양 중에 반응 혼합물을 교반해야 합니다.
산물 플레이트가 있는 분석 키트 플레이트를 원심분리기에 놓고 2,700 x g으로 10분 동안 회전시켜 반응 산물을 산물 플레이트의 웰로 옮깁니다.
회전 후 제품 플레이트를 육안으로 검사하여 각 웰의 액체 부피가 거의 동일한지 확인합니다. 플레이트 리더를 사용하여 다양한 녹색 CPH 기판에 대해 630나노미터에서 수집 플레이트의 흡광도를 판독합니다.