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생물학적 기술
0 조회수 • 3:27 분 • July 8th, 2025
바이오매스는 주로 복합 다당류로 구성된 식물 유래 유기물입니다. 탄수화물 분해 효소는 이러한 다당류에 작용하여 더 작은 올리고당을 생성합니다.
효소의 분해 활성을 평가하려면 다공성 반응판의 웰에 존재하는 다양한 불용성 발색 바이오매스(ICB 기질)를 취하는 것부터 시작하십시오. 이러한 기질은 특정 색상의 클로로트리아진 염료로 식물 유래 물질을 염색하여 얻습니다. 생성된 바이오매스에는 효소 활성의 기질 역할을 하는 염료 태그가 붙은 복합 다당류가 있습니다.
이제 탄수화물 가수분해 효소를 함유한 완충액을 첨가합니다. 완충액은 최적의 효소 활성을 위해 pH를 유지합니다. 반응판을 셰이커에 놓고 배양합니다. 지속적인 교반을 통해 효소 분자는 ICB 기질의 표적 다당류에 도달할 수 있습니다.
배양하는 동안 가수분해 효소는 장쇄 다당류 내에서 공유 글리코시드 결합을 절단합니다. 이 반응은 용액에 남아 있는 염료 분자와 결합된 가용성 올리고당을 생성합니다.
분해가 완료되면 반응판을 제품 플레이트 위에 놓고 어셈블리를 원심분리합니다. 원심분리 중에 반응 생성물을 포함하는 유색 용액은 플레이트 바닥의 필터를 통과하여 제품 플레이트에 수집됩니다. 플레이트 리더를 사용하여 상청액의 흡광도를 기록합니다.
흡광도 값이 높을수록 많은 수의 염료 결합 올리고당이 생성됨을 나타내며, 이는 ICB 기질을 분해하는 효소의 효율성을 나타냅니다.
적색 불용성 발색 바이오매스 또는 ICB-밀짚을 사용하여 발색 분석을 수행하려면 먼저 분석 플레이트의 각 웰에 200마이크로리터의 활성화 용액을 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 10분 동안 교반하지 않고 실온에서 배양합니다.
100마이크로리터의 멸균수를 사용하여 우물을 세 번 세척하여 안정제를 제거합니다. 그런 다음 150마이크로리터의 100밀리몰 아세테이트나트륨 완충액, pH 4.5 및 밀리리터당 5마이크로리터의 10단위의 다른 엔도-자일라나제 용액을 추가합니다.
제품 플레이트를 기판 플레이트 아래에 배치하여 쉐이킹 중 기판 플레이트에서 잠재적인 누출을 수집하고 실온 및 100RPM에서 2시간 동안 반응을 배양합니다.
배양 후, 산물 플레이트가 아래에 있는 분석 키트 플레이트를 원심분리기에 넣고 2,700 x g에서 10분 동안 회전시켜 반응 생성물을 산물 플레이트의 웰에 옮깁니다.
각 웰의 액체 양이 거의 동일한지 확인하십시오. 그런 다음 플레이트 리더를 사용하여 빨간색 ICB-밀짚에 대해 517나노미터에서 수집 플레이트의 흡광도를 읽습니다.