0 조회수 • 4:31 분 • July 8th, 2025
미토칸은 암세포에서 미토콘드리아의 기능에 선택적으로 영향을 미치고 세포사멸을 유도하는 약물의 일종입니다.
미토칸 세포독성을 결정하려면 반부착 암세포를 포함하는 세포 현탁액을 멀티웰 플레이트에 시드합니다. 원하는 미토칸 용액으로 플레이트를 처리하고 배양합니다.
미토칸은 암세포에 들어가 미토콘드리아 활동을 방해하고 결국 미토칸에 민감한 암세포의 세포 사멸을 초래합니다. Hoechst 염료와 요오드화 프로피듐의 혼합물을 포함하는 염색 용액으로 세포를 처리합니다.
막 투과성 형광 염료인 Hoechst는 모든 세포에 침투하여 DNA의 AT가 풍부한 영역에 결합하여 살아있는 세포와 죽은 세포의 핵에 청색 형광을 부여합니다.
대조적으로, 막 불투과성 형광 염료인 요오드화 프로피듐은 막의 손상된 부분을 통해서만 죽은 세포에 들어갑니다. 염료는 DNA 염기 사이에 삽입되어 죽은 세포에 추가적인 적색 형광을 부여합니다. 이 세포의 핵에 두 가지 염료가 모두 존재하면 죽은 세포가 보라색으로 보입니다.
플레이트를 저속으로 원심분리하여 이미징 중 정확도를 높이기 위해 세포를 침전시킵니다. 형광 현미경으로 이미지를 찍고 두 개의 서로 다른 세포 집단을 관찰합니다. 두 셀 유형의 수를 계산합니다.
전체 모집단과 비교하여 죽은 집단을 나타내는 보라색 세포의 백분율은 테스트 미토칸의 세포독성 가능성을 나타냅니다.
원하는 농도로 관심 화합물의 용액을 준비하는 것부터 시작하십시오. 항상 화합물을 완전히 소용돌이하여 혼합하십시오.
단일 화합물의 세포독성을 측정하려면 최종 농도의 2배로 화합물을 준비하십시오. 화합물 조합의 세포독성을 측정하는 경우 4X 최종 농도로 준비하십시오.
동일한 양의 용매를 적절한 배지와 혼합하여 용매 전용 대조군을 준비합니다. 세포를 15밀리리터 원뿔형 튜브에 모으고 트리판 블루 염색을 위해 세포 현탁액 10마이크로리터를 분취합니다. 분취량에 0.4% 트리판 블루 10마이크로리터를 추가하고 혈구계 또는 세포 계수기를 사용하여 생존 가능한 세포와 생존 불가능한 세포를 계산합니다.
15밀리리터 튜브에 200 x g으로 5분 동안 펠릿 세포를 넣은 다음 상청액을 흡인하거나 디캔팅합니다. 밀리리터당3x10 5세포의 세포 밀도로 분석에 적합한 배지에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 50마이크로리터의 세포 현탁액을 96웰 플레이트의 각 웰에 시드합니다.
단일 화합물 분석의 경우 각 웰에 50마이크로리터의 2X 화합물 용액을 추가합니다. 용매 제어 웰의 경우 2X 농도의 용매가 포함된 테스트 배지 50마이크로리터를 추가합니다. 조합 분석의 경우 각 웰에 4X 화합물 각각을 25마이크로리터 첨가합니다. 단일 화합물 대조군 웰의 경우 4X 화합물 용액 및 시험 배지를 각각 25마이크로리터씩 추가합니다. DMSO의 최종 농도가 0.5%를 초과하지 않는지 확인하십시오.
재현성을 보장하려면 피펫 팁이 웰 측면에 닿도록 약물을 추가하고 약물을 다른 위치에 추가하도록 주의하십시오. 이 단계는 매우 신속하게 수행되어야 하며, 가급적이면 플레이트당 30분 이상 걸리지 않습니다.
플레이트를 가볍게 두드려 웰의 내용물을 혼합하고 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%에서 배양합니다.
Hoechst 33342 및 요오드화 프로피듐으로 세포를 염색할 준비가 되면 신선한 10X 염색 용액을 준비하고 각 웰에 10마이크로리터를 추가합니다. 접시를 가볍게 두드리고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다.
플레이트를 200 x g으로 4분 동안 원심분리하여 모든 세포를 플레이트 바닥으로 가져옵니다. 그런 다음 광고로 플레이트 바닥을 조심스럽게 닦으십시오.amp 실험실 물티슈 이미징을 방해할 수 있는 이물질을 제거합니다. 원심분리 후 15분 이내에 플레이트를 이미지
화합니다.