용혈 분석: 인간 적혈구에서 칼슘 이오노포어에 의한 용해를 측정하는 시험관 내 방법

용혈은 적혈구가 파열되어 세포 내용물을 주변 공간으로 방출하는 것입니다.

용혈을 분석하려면 체액에 비해 포도당이 없고 전해질이 함유된 등장성 용액에 적혈구가 들어 있는 튜브로 시작합니다. 이 용액은 적혈구를 온전하게 유지하고 포도당이 없으면 세포 스트레스가 유발됩니다. 이것은 양이온 채널을 활성화하여 칼슘 이온이 세포질의 공간으로 들어갈 수 있도록 합니다.

칼슘 이온을 결합하고 세포질로의 수송을 촉진하여 적혈구 내부에 칼슘 이온의 과부하를 유발하는 최적의 칼슘-이오노포어 농도를 포함하는 용액을 추가합니다.

이러한 유입은 원형질막의 지질 단층 사이에서 인지질을 전위시키는 단백질인 스크램블라제를 활성화하여 비대칭성을 방해합니다. 이 현상은 또한 내부 단층 인지질인 포스파티딜세린을 적혈구의 프로그램된 사멸인 적립증의 지표인 외부 단층으로 이동시킵니다.

세포질 칼슘 이온의 증가는 칼륨 채널을 활성화하고 칼륨 이온을 세포 밖으로 몰아냅니다. 삼투압 불균형은 수분 손실과 적혈구 수축으로 이어집니다. 칼슘 이오노포어에 더 오래 노출되면 용혈이 유발되어 헤모글로빈이 용액으로 누출됩니다.

적혈구 현탁액을 원심분리하고 상청액의 흡광도를 측정하여 용혈된 적혈구에서 방출되는 헤모글로빈의 양을 정량화합니다.

1mg의 이오노마이신-칼슘염을 630마이크로리터의 DMSO에 녹여 최종 농도 2밀리몰에 도달합니다. 20마이크로리터에 분취하여 섭씨 영하 20도에서 보관합니다.

준비된 0.4% 헤마토크리트 1ml를 취하고 0.5밀리몰 이오노마이신 2마이크로리터를 첨가하여 최종 농도 1마이크로몰에 도달합니다. 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 음성 대조군으로 이오노마이신 처리하지 않은 헤마토크리트 1밀리리터를 사용합니다. 이오노마이신 처리 및 미처리 헤마토크리트를 실온에서 5분 동안 700배 g으로 원심분리하고 상청액을 제거하여 튜브 바닥에 세포 펠릿을 남깁니다.

세포 펠릿을 1.5밀리리터의 링거 용액에 현탁시키고 실온에서 5분 동안 700배g으로 원심분리한 다음 상청액을 버려 링거 용액으로 세포를 3회 세척합니다.

용혈을 측정하려면 미처리된 0.4% 헤마토크리트 1밀리리터를 미세원심분리기 튜브에 넣고 용혈의 0%에서 음성 대조군으로 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다.

100% 용혈의 양성 대조군을 준비하려면 미처리된 0.4% 헤마토크리트 1밀리리터를 미세원심분리관에 넣고 실온에서 700배g으로 5분간 원심분리 한다. 상청액을 제거하고