Annexin V 결합 분석: 포스파티딜세린 라벨링을 통해 세포사멸 적혈구를 식별하는 형광 기반 기술

특정 병리학적 상태 동안 적혈구 또는 적혈구는 막 인지질(포스파티딜세린)의 전좌를 동반한 세포 수축을 겪어 프로그램된 세포 사멸, 적립증을 유발하여 대식세포 매개 세포 식균 작용을 유발합니다.

Annexin V 결합 분석을 통해 분리된 인간 적혈구 집단에서 이오노포어 유도 적혈구증을 측정하려면 포도당이 없는 완충액에 현탁된 적혈구로 시작합니다.

포도당 고갈은 세포 스트레스를 유도하여 세포질 단백질 키나아제 C를 활성화하고, 이는 이후 칼슘 채널을 활성화하고 칼슘 이온 유입을 유발합니다. 또한 칼륨 채널이 활성화되어 칼륨 유출과 세포 수축을 유발합니다.

다음으로, 세포외 칼슘 이온과 안정한 복합체를 형성하는 칼슘 이오노포어를 첨가한다. 이 복합체는 세포막을 가로질러 칼슘 이온의 세포질 진입을 촉진하여 세포내 칼슘 농도를 더욱 증가시킵니다. 이것은 차례로 양방향 인지질 수송체인 스크램블라제를 활성화하여 포스파티딜세린의 내부 세포막 전단지에서 외부 세포막 전단지로 전좌하는 데 도움을 주어 막 비대칭을 줄이고 적립증을 유도합니다.

이오노포어 처리된 적혈구를 원심분리합니다. 칼슘 함유 결합 완충액에 세포를 재현탁합니다. 형광 염료 접합 Annexin V 용액을 첨가합니다.

높은 포스파티딜세린 친화력을 갖는 칼슘 의존성 인지질 결합 단백질인 Annexin V는 외세포막 전단지상의 노출된 포스파티딜세린 잔기에 결합합니다.

형광 활성화 세포 분류를 사용하여 Annexin V 형광 강도에 따라 적혈구 집단을 분리합니다. 에립토성 적혈구는 건강한 적혈구보다 더 높은 Annexin V 형광 강도를 나타냅니다.

5X Annexin V 결합 완충액 2밀리리터를 PBS 8밀리리터에 희석하여 1X 결합 완충액을 얻습니다. 이오노마이신 처리 및 처리되지 않은 세포 펠릿을 1X 결합 완충액 1밀리리터에 재현탁합니다.

결합 완충액에 235마이크로리터의 세포 현탁액을 취하고 15마이크로리터의 Annexin V-Alexa Fluor 488 접합체를 미세 원심분리기 튜브에 첨가합니다. 세포를 어두운 곳에서 실온에서 20분 동안 배양합니다.

실온에서 700 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거합니다. 세포 펠릿을 1.5밀리리터의 결합 완충액에 현탁시키고 실온에서 5분 동안 700 x g으로 원심분리하여 1X 결합 완충액으로 세포를 두 번 세척합니다.

상청액을 제거하고 유세포 분석을 위해 세포 펠릿을 250마이크로리터의 1X 결합 완충액에 재현탁합니다. 이제 200마이크로리터의 Annexin V-염색 적혈구를 유세포 분석과 호환되는 1밀리리터 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다.

유세포 분석 소프트웨어에 로그인하고 '새 실험' 버튼을 클릭합니다. '새 튜브' 버튼을 클릭하고 '글로벌 시트'를 선택한 다음 '분석 적용'을 선택하여 여기 파장 488나노미터, 방출 파장 530나노미터로 형광 강도를 측정합니다.

형광 활성화 세포 분류 분석을 위해 수집할 세포 수를 20,000개로 설정합니다. 원하는 튜브를 선택하고 '로드' 버튼을 클릭합니다. 전방 산란 및 측면 산란 측정을 위해 '기록' 버튼을 클릭하십시오. 모든 샘플에 대해 반복합니다.

'시편' 버튼을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 '배치 분석 적용'을 클릭하여 결과 파일을 생성합니다. '표본' 버튼을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 'FSC 파일 생성'을 클릭합니다.