In vitro glucose depletion assay: 세포외 포도당 고갈 측정을 통해 세포 포도당 흡수를 정량화하는 형광 기반 방법

주요 세포 에너지원인 포도당은 세포막 포도당 수송체 단백질을 통해 세포로 들어갑니다. 포도당은 해당작용 경로를 통해 세포 세포질에서 피루브산으로 분해되어 세포 대사를 위한 아데노신 삼인산(ATP)을 통해 에너지를 생성합니다.

세포내 포도당 흡수를 측정하려면 멀티웰 플레이트에서 섬유아세포의 부착 배양으로 시작합니다. 배지를 포도당이 없는 배지로 교체하고 배양합니다. 세포는 사용 가능한 포도당을 대사하여 에너지를 생산하고 포도당 결핍 상태에 도달합니다.

한 웰 세트의 배지를 포도당 흡수 자극제인 인슐린과 포도당 유사체인 형광 데옥시글루코스를 포함하는 무포도당 배지로 교체합니다. 형광 데옥시글루코스를 함유한 포도당이 없는 배지로 다른 웰 세트를 처리합니다.

배양하는 동안 인슐린은 추가 포도당 수송체의 원형질막으로의 이동을 자극하여 포도당이 없을 때 형광 데옥시글루코스 흡수 증가를 촉진합니다.

데옥시글루코스는 인산화되어 세포에 의해 더 이상 대사되지 않습니다. 동시에 형광 데옥시글루코스의 세포외 농도가 감소합니다.

배양 후, 사용하지 않은 형광 데옥시글루코스를 포함하는 배지를 수집합니다. 용해 완충액으로 세포를 처리합니다. 완충액의 세제는 미셀을 형성하고 세포막을 가용화하여 세포내 내용물 방출을 유발합니다.

마이크로플레이트 리더를 사용하여 세포내 형광 데옥시글루코스를 함유한 세포 균질체와 활용되지 않은 세포외 형광 데옥시글루코스를 함유한 배지의 형광을 측정합니다.

인슐린 자극 섬유아세포는 자극되지 않은 세포에 비해 세포내 형광 데옥시글루코스 흡수가 증가하고 그에 상응하는 세포외 형광 데옥시글루코스가 감소합니다.

각 시뮬레이션 조건에 대해 8개의 반복실험을 사용합니다. 따라서 각 시뮬레이션 조건에 대해 1밀리리터를 준비합니다.

인슐린 없이 7가지 시뮬레이션 조건을 사용합니다: 1개의 96웰 플레이트에 2.5마이크로그램/밀리리터, 1마이크로그램/밀리리터, 0.5마이크로그램/밀리리터, 0.2마이크로그램/밀리리터, 0.1마이크로그램/밀리리터, 0.05마이크로그램/밀리리터 및 밀리리터당 0밀리그램의 FD-포도당.

인슐린과 함께 7가지 자극 조건을 사용합니다: 다른 96웰 플레이트에서 밀리리터당 2.5마이크로그램, 밀리리터당 1마이크로그램, 밀리리터당 0.5마이크로그램, 밀리리터당 0.2마이크로그램, 밀리리터당 0.1마이크로그램, 밀리리터당 0.05마이크로그램, 밀리리터당 0마이크로그램

자극 조건을 준비하려면 1마이크로리터의 5밀리그램 FD-포도당 작용 용액과 999마이크로리터의 무포도당 DMEM을 희석하여 1밀리리터의 작용 원액을 얻습니다.

이 작업 원액을 사용하여 1:2000, 1:5000, 1:10000, 1:25000, 1:50000 및 1:100,000 희석액을 준비하여 조명이 없는 생물안전 캐비닛에서 실험 직전에 2밀리리터 튜브에 2밀리리터당 2.5마이크로그램, 밀리리터당 1마이크로그램, 밀리리터당 0.5마이크로그램, 밀리리터당 0.2마이크로그램, 밀리리터당 0.1마이크로그램, 밀리리터당 0.05마이크로그램을 얻습니다. 이러한 각 조건에 1마이크로리터의 인슐린을 추가합니다.

양 40분 후, 96웰 플레이트의 각 웰에서 포도당이 없는 DMEM을 디캔팅하고 멸균 종이 타월로 남은 액체를 흡수합니다. 앞서 설명한 다양한 처리 조건에서 각각 100마이크로리터를 하나의 컬럼을 따라 웰에 추가하고, 동일한 처리 조건에서 100마이크로리터를 두 96웰 플레이트의 행을 따라 웰에 추가합니다. 인슐린 유무에 관계없이 조건을 활용한 플레이트에 라벨을 붙입니다.

포도당 DMEM을 대조군 웰에 단독으로 추가합니다. 어두운 곳에서 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 40분 동안 배양합니다.

세포가 40분 동안 자극된 후, 동일한 실험 레이아웃을 유지하면서 두 플레이트의 자극 배지를 새로운 96웰 플레이트로 옮깁니다. PBS로 세포를 세척합니다. PBS를 제거하고 멸균 종이 타월에 남아 있는 용액을 디캔팅합니다.

단백질을 보호하기 위해 방사성 면역침전 분석 완충액에 프로테아제 억제제를 첨가합니다. 방사성 면역침전 분석이 포함된 플레이트를 셰이커에 30분 동안 넣습니다.

마이크로플레이트 리더를 사용하여 각각 485 및 535나노미터의 여기 및 방출 파장에서 형광을 먼저 세포외 FD-포도당을 포함하는 배지에서 측정한 다음 30분 배양이 끝날 때 방사성 면역침전 분석으로 용해된 세포가 있는 플레이트를 측정합니다.