세포 외 형광 포도당 아날로그 고갈 측정: 생체 외 마우스 장기의 포도당 흡수를 평가하기 위한 대리 측정 기법

조직에서 세포외 포도당은 특정 포도당 수송체를 통한 촉진된 확산을 통해 세포로 들어갑니다.

포도당은 대사 경로인 해당작용을 통해 세포 세포질에서 피루브산으로 분해되어 세포 대사 과정을 위한 아데노신 삼인산(ATP) 형태의 에너지를 생성합니다.

생체 외에서 포도당 흡수를 측정하려면 갓 채취한 작은 크기의 마우스 간 조직으로 시작합니다. 생리적 조건을 유지하기 위해 적절한 완충액을 추가합니다.

다음으로, 조직을 포도당이 없는 배지가 들어 있는 멀티웰 플레이트로 옮깁니다. 형광 표지된 포도당 유사체인 데옥시글루코스가 보충된 무포도당 배지에서 배양하여 이를 따릅니다. 조직의 크기가 작기 때문에 데옥시글루코스가 들어갈 수 있습니다.

데옥시글루코스는 포도당이 없을 때 포도당 수송체를 통해 세포로 들어갑니다. 세포 내에서 데옥시글루코스는 인산화를 겪지만 더 이상 대사되지 않아 축적됩니다.

원하는 시점에서 사용하지 않는 형광 표지 데옥시글루코스를 포함하는 배지를 수집합니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 세포외 데옥시글루코스의 형광을 측정하며, 이는 세포내 조직 데옥시글루코스의 흡수와 상관관계가 있을 수 있습니다.

수확한 조직 또는 장기를 PBS가 포함된 6웰 플레이트에서 1분 동안 배양합니다. 각 조직이나 기관을 별도의 우물에서 다루십시오. 1분 후 각 티슈를 멸균 종이 타월 위에 올려 PBS를 흡수합니다.

4,000마이크로리터의 포도당이 없는 DMEM이 들어 있는 별도의 6웰 플레이트에 조직 또는 기관을 옮기고 2분 동안 배양합니다. 2분 후, 조직을 제거하고 0.29밀리몰 FD-포도당 작동 용액이 들어 있는 6웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 조직을 포함하는 6웰 플레이트를 섭씨 37도의 FD-포도당 작업 용액에 배양합니다.

0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 및 120분의 배양 후 각 웰에서 100마이크로리터의 FD-포도당 작업 용액을 수집하고, 수집된 100마이크로리터의 FD-포도당 작업 용액을 96웰 플레이트로 옮겨 세포외 FD-포도당 고갈의 동역학을 분석합니다. 수집 전후에 흔들어주세요.

마이크로플레이트 리더를 사용하여 각각 485 및 535 나노미터의 여기 및 방출 파장에서 형광을 측정합니다.