Gliding Actin Filament Assay: 고정된 Myosins에 대한 Actin 필라멘트의 전좌를 연구하기 위한 In Vitro Motility Assay

운동 단백질인 미오신은 또 다른 사상 단백질인 액틴과 상호 작용하여 전좌를 일으킵니다.

액틴의 활공 운동을 분석하려면 챔버 상단의 내부 부분이 니트로셀룰로오스 코팅되도록 유리 슬라이드 기반 흐름 챔버를 조립합니다. 챔버를 통해 미오신 단백질이 흐르고, 이는 니트로셀룰로오스 코팅 위에 고정됩니다.

표지되지 않은 액틴 필라멘트(검은색 액틴)로 챔버를 보충하고 아데노신 삼인산 또는 ATP 분자를 포함하는 운동성 완충액을 추가합니다.

액틴 필라멘트는 비활성 또는 죽은 미오신과 함께 고정화된 활성 미오신에 결합합니다. ATP 분자는 활성 미오신과 상호 작용하여 검은색 액틴에서 해리되는 반면 비활성 미오신은 액틴 결합 상태를 유지합니다.

검은색 액틴에 부착된 비활성 미오신을 펠릿화하기 위한 원심분리기. 완충액으로 철저히 헹구어 비활성 미오신 펠릿, 유리 액틴 필라멘트 및 사용하지 않은 ATP를 제거합니다. 고정된 활성 미오신에 결합하는 형광 표지 액틴의 흐름.

밀집제(메틸셀룰로오스 및 ATP)를 포함하는 최종 완충액으로 챔버를 보충합니다. 밀집제는 액틴 필라멘트가 챔버 표면에 더 가깝게 유지되도록 합니다.

각 활성 미오신은 ATP를 가수분해하여 형태 변화를 일으키고 필라멘트를 따라 새로운 위치에 결합하여 미오신 위로 액틴을 미끄러지게 하는 파워 스트로크를 생성합니다.

형광 현미경으로 챔버를 관찰하여 고정된 미오신 헤드 위로 부드럽게 미끄러지는 표지된 액틴 필라멘트의 움직임을 기록하여 성공적인 전좌를 확인합니다.

시작하려면 아밀 아세테이트에 1% 니트로셀룰로오스 용액을 준비하고 조직 배양 플레이트 바닥에 직경 125mm의 원형 여과지를 놓습니다.

정사각형 커버슬립 8개를 랙에 넣고 약 2-5밀리리터의 200프루프 에탄올로 철저히 세척한 다음 2-5밀리리터의 증류수로 철저히 세척합니다. 그런 다음 여과된 공기 라인 또는 질소 라인을 사용하여 커버슬립을 완전히 건조시킵니다.

10마이크로리터의 1% 니트로셀룰로오스 용액을 커버슬립의 한쪽 가장자리를 따라 천천히 피펫팅합니다. 200마이크로리터 피펫 팁의 측면을 사용하여 커버슬립의 나머지 부분에 1번의 부드러운 동작으로 바르십시오. 그런 다음 이 커버슬립을 니트로셀룰로오스 면이 위로 향하게 하여 조직 배양 접시에 놓습니다. 나머지 커버슬립에 대해 이 작업을 반복하고 건조시키십시오.

광학 렌즈 용지로 현미경 슬라이드를 닦아 큰 잔해물을 닦아냅니다. 양면 테이프 2개를 약 2cm 길이