Inverted Motility Assay: An In Vitro technique to visualize myosin movement on immobilized actin filaments(반전 운동성 분석: 고정된 액틴 필라멘트에서 미오신 이동을 시각화하는 In vitro 기술)

운동 단백질인 미오신은 사상 단백질인 액틴과 상호 작용하는 구형 머리 도메인을 가지고 있습니다. 이 상호 작용은 액틴 필라멘트를 따라 미오신의 전좌에 필수적입니다. 시험관 내에서 이 결합을 연구하기 위해 표면 테더링된 액틴에 대한 미오신의 역운동성 분석을 수행합니다.

시작하려면 코팅된 표면이 내부를 향하도록 현미경 슬라이드 위에 비오티닐화된 폴리에틸렌 글리콜(PEG 코팅 커버슬립)을 배치하여 챔버의 상단을 만들어 분석 챔버를 조립합니다.

당단백질인 아비딘이 함유된 용액을 챔버에 통과시킵니다. 아비딘은 높은 친화력으로 비오틴에 결합하여 액틴 접착력을 향상시킵니다. 다음으로, 적색 형광단으로 표지된 비오틴 태그가 부착된 액틴 필라멘트의 흐름입니다. 비오틴 리간드는 아비딘에 결합하여 커버슬립 표면의 필라멘트를 고정시킵니다.

마지막으로, 녹색 형광 단백질 표지 미오신 5A 단백질을 아데노신 삼인산(ATP) 분자를 포함하는 완충액에 첨가합니다. 후행 머리와 선행 머리를 포함하는 이중 머리 미오신 5A는 고정된 액틴 필라멘트와 상호 작용합니다. 미오신의 후행 머리는 ATP에 결합하고 액틴에서 분리됩니다.

ATP의 가수분해는 파워 스트로크를 생성하여 후행 헤드가 필라멘트를 따라 선행 헤드 앞의 위치에 결합할 수 있도록 합니다. 연속적인 파워 스트로크를 통해 미오신은 분리되지 않고 고정된 액틴 필라멘트를 따라 이동합니다.

형광 현미경을 사용하여 빨간색 액틴 필라멘트에서 녹색 미오신 분자의 움직임을 기록합니다.

미오신 5a 역운동성 분석을 위한 용액을 준비하고 얼음 위에 보관합니다.

DTT로 10마이크로리터의 운동성 완충액으로 챔버를 세척합니다. DTT가 있는 운동성 완충액에서 밀리리터당 1밀리그램 BSA의 10마이크로리터로 유동합니다. 세 번째 세탁 후 잠시 기다리면서 이것을 두 번 반복합니다. 티슈 또는 여과지를 사용하여 플로우 챔버 출구에 종이의 모서리를 부드럽게 놓아 채널을 통해 용액을 흡수합니다.

그런 다음 DTT로 10마이크로리터의 운동성 완충액으로 챔버를 세 번 세척합니다. DTT가 있는 운동성 완충액에 10마이크로리터의 NeutrAvidin 용액을 넣고 1분 동안 기다립니다. 그런 다음 10마이크로리터의 용액으로 세 번 씻습니다.

큰 구멍이 있는 피펫 팁을 사용하여 DTT와 함께 10마이크로리터의 bRh-액틴 함유 운동성 완충액을 흐르게 하고 1분 동안 기다립니다. 그런 다음 DTT와 함께 10마이크로리터의 운동성 완충액으로 세 번 세척합니다.

10나몰 미오신 5a가 포함된 30마이크로리터의 최종 완충액을 넣고 즉시 전체 내부 반사 형광 현미경에 로드합니다. TIRF 이미징에 대한 최적의 초점이 발견되면 기록을 시작합니다.