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장 오가노이드는 죽은 세포와 파편으로 구성된 중앙 내강을 갖는 장과 같은 선와융모 조직을 요약합니다. 내강은 융모와 같은 세포와 줄기 세포를 품고 있는 싹트는 선와와 같은 돌출부로 늘어서 있습니다.
다른 오가노이드 세포는 다양한 수준의 활성 산소종, ROS(대사 활동의 부산물)를 생성하며, 축적되면 산화 스트레스가 발생합니다.
다양한 세포에서 산화 스트레스를 시각화하려면 기저 매트릭스에 배양된 3D 오가노이드가 포함된 멀티웰 플레이트를 가져가는 것부터 시작합니다. 오가노이드 줄기 세포는 이미징 중에 구별하는 데 도움이 되는 녹색 형광 단백질 또는 GFP 태그 단백질을 발현합니다.
ROS 유도제인 tert-부틸 하이드로퍼옥사이드로 웰을 보충하고 배양합니다. 유도제는 막에 결합된 NADPH 산화효소를 활성화하고 세포 내부의 ROS 생성을 자극합니다. 대사적으로 활발한 줄기세포는 분화된 세포보다 더 많은 ROS를 생성합니다.
ROS에 민감한 형광 프로브를 추가합니다. 이러한 친유성 프로브는 세포에 빠르게 들어가 ROS와 반응하여 적색 형광을 생성합니다. 살아있는 세포 핵을 선택적으로 염색하는 Hoechst 염료로 오가노이드를 처리합니다. 공초점 현미경을 사용하여 오가노이드를 이미지화합니다.
염색된 핵이 있는 주변부의 오가노이드 세포는 다양한 정도의 적색 형광을 나타내며, 이는 GFP 발현 줄기 세포에서 높고 분화된 세포에서는 낮습니다. 본질적으로 ROS 수준이 높은 죽은 세포는 내강에서 적색 형광을 나타냅니다.
적색 형광의 강도는 다양한 세포 유형에서 다양한 수준의 산화 스트레스와 관련이 있습니다.
공초점 현미경으로 산화 스트레스를 시각화하려면 오가노이드로 도금된 마이크로슬라이드 8웰 챔버의 해당 웰에 1마이크로리터의 N-아세틸시스테인 원액을 추가합니다.
1시간 배양 후, 해당 웰에 1마이크로리터의 Tert-부틸 하이드로퍼옥사이드 원액을 첨가하고 30분 더 배양합니다. 다음으로, 웰당 형광 프로브의 1.25밀리몰 희석액 중 1마이크로리터를 첨가한 다음 밀리리터당 1.25밀리그램의 Hoechst 용액 1마이크로리터를 추가합니다.
또 다른 30분 배양 후, BMM을 방해하지 않고 배지를 제거하고 페놀 레드가 없는 따뜻한 DMEM 250마이크로리터를 부드럽게 첨가합니다.
형광 프로브를 감지하는 열 챔버와 가스 공급 장치가 장착된 공초점 현미경을 사용하여 오가노이드를 이미지
화합니다.
포지티브 컨트롤을 사용하여 ROS 신호에 대한 레이저 강도와 시간 노출을 설정하고 이 신호가 네거티브 컨트롤에서 더 낮은지 확인합니다. 다음으로, 접안렌즈를 사용하여 슬라이드를 스크리닝하여 GFP를 발현하는 오가노이드를 식별하고 레이저 강도를 조정합니다.
25마이크로미터의 z-스택을 설정하고 위치를 정의하여 전체 오가노이드의 스티칭 이미지를 얻어 세포의 한 층을 보여주는 오가노이드 섹션을 얻습니다.