0 조회수 • 3:29 분 • July 8th, 2025
장 세포는 활성 산소종인 ROS를 생성합니다. 적당한 ROS 수치는 세포 항상성을 유지하는 반면, 높은 ROS 수치는 세포 사멸을 유발할 수 있습니다.
시험관 내에서 ROS 수준을 정량화하려면 마우스 장 3D 오가노이드 배양으로 시작합니다. 이 오가노이드는 녹색 형광 발현 줄기 세포를 품고 있는 선와와 같은 돌기를 갖는 장-상피 구조를 나타냅니다. 그들은 또한 죽은 세포와 파편으로 구성된 중앙 내강을 둘러싸고 있는 주변에 융모와 같은 분화된 세포를 포함합니다. 이 모든 세포는 서로 다른 수준의 ROS를 생성합니다.
이제 지정된 웰의 오가노이드를 ROS 조절제로 처리합니다. 그 특성에 따라 조절제는 ROS 유도제 또는 억제제 역할을 할 수 있습니다. 필요한 시간 동안 배양한 후 사용한 배지를 제거합니다.
배양액에 단백질 분해 효소를 첨가하여 오가노이드의 3D 구조를 파괴하고 현탁액으로 다른 세포를 방출합니다. 다음으로, ROS에 민감한 형광 프로브를 추가하고 배양합니다.
세포에 들어가면 프로브는 ROS와 반응하여 산화되어 적색 형광을 생성합니다. 죽은 세포의 핵을 선택적으로 염색하여 살아있는 세포와 대비를 만드는 DNA 결합 형광 염료인 DAPI로 세포를 처리합니다.
유세포 분석기를 사용하여 DAPI 음성 살아있는 세포를 분석하여 ROS 수준에 해당하는 적색 형광 신호를 얻습니다. 조절제의 특성에 따라 유도제는 ROS 수준을 증가시키는 반면 억제제는 ROS 수준을 감소시킵니다.
오가노이드를 포함하는 96웰 둥근 바닥 플레이트의 음성 대조군 웰에 1마이크로리터의 N-아세틸 시스테인 원액을 첨가합니다.
1시간 배양 후, 해당 웰에 1마이크로리터 Tert-부틸 하이드로퍼옥사이드 원액을 넣고 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 다중 채널 피펫을 사용하여 부착된 BMM을 방해하지 않고 배지를 제거하고 다른 96웰 둥근 바닥 플레이트로 옮깁니다. 이 접시는 따로 보관하십시오.
그런 다음 100마이크로리터의 트립신을 추가하고 다중 채널 피펫을 사용하여 위아래로 5회 피펫을 사용하여 BMM을 파괴합니다. 짧은 5분 배양 후, 두 번째로 위아래로 피펫팅하여 오가노이드를 해리합니다.
플레이트를 돌리고 플레이트를 뒤집어 상청액을 버립니다. 이전에 다른 96웰 플레이트에 수집된 배지를 해당 웰에 다시 추가하고 위아래로 5회 피펫팅하여 세포를 다시 현탁합니다.
다음으로, 1마이크로리터의 형광 프로브를 추가하고 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 플레이트를 다시 회전시키고 250마이크로리터의 DAPI 용액으로 세포를 다시 현탁합니다. 유세포 분석 튜브에 샘플을 옮기고 튜브를 얼음 위에 보관합니다.
단일 염색 샘플을 사용하여 각 형광단에 대해 염색되지 않은 제어 및 레이저 전압에 대한 전방 및 측면 산란 전압 설정을 최적화합니다. 그런 다음 적절한 게이팅 전략을 사용하여 최소 20,000개의 이벤트를 수집합니다.