SUMOylation Assay: 면역블로팅을 통해 기질 단백질의 SUMOylation 상태를 검출하는 In vitro 기술

SUMOylation은 작은 유비퀴틴 유사 변형제인 SUMO가 기질 단백질에 부착되어 발생합니다.

SUMOylation은 성숙한 SUMO 펩타이드가 효소인 E1에 의해 활성화될 때 발생합니다. 활성화 시 SUMO는 접합 효소(E2)의 활성 부위로 전달되어 SUMO를 기질 단백질의 라이신 잔기에 부착합니다. 또 다른 리가아제인 E3는 이 상호 작용의 효율성을 향상시킵니다.

시험관 내 SUMOylation 분석을 수행하려면 기질 단백질인 p53, 효소 및 SUMO 펩타이드의 혼합물이 들어 있는 튜브로 시작하여 SUMOylation을 유도하기 위해 배양합니다. SDS 함유 완충액인 도데실 황산나트륨으로 튜브를 보충하여 반응을 종료합니다. 단백질을 변성시키기 위해 샘플을 가열합니다.

단백질 혼합물을 SDS-PAGE 겔의 웰에 로드하고 전기영동을 수행합니다. 분자량이 높은 SUMOylated 단백질은 SUMOylated가 아닌 변이체보다 느리게 이동하여 두 개의 별개의 밴드를 생성합니다.

전기 블로팅 장치의 젖은 여과지 위에 있는 블로팅 멤브레인에 젤을 옮깁니다. 젖은 여과지로 덮고 젤에서 멤브레인으로 단백질을 전기 전사합니다.

p53에 결합하는 항-p53 항체로 막을 처리합니다. 항체-p53 복합체에 결합하는 효소 접합 2차 항체와 오버레이. 화학발광 기판을 추가하여 발광 제품을 생성하고 멤브레인을 이미지화합니다.

더 높은 분자량 밴드는 SUMO일화된 단백질에 해당하고, 더 낮은 밴드는 비-SUMO일화된 단백질 변이체에 해당합니다.

시험관 내 SUMOylation 마스터 믹스 반응에서 정제된 tag-K-bZIP 마이크로리터당 100나노그램 3마이크로리터를 첨가합니다. 그런 다음 마스터 믹스의 내용물을 부드럽게 혼합하고 섭씨 30도에서 3시간 동안 배양합니다.

다음으로, 로딩 버퍼와 함께 20마이크로리터의 2x SDS-PAGE를 첨가하여 반응을 중지합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 95도에서 5분 동안 가열하여 단백질을 변성시킵니다.

다음으로, 20 마이크로리터의 샘플을 10% SDS-PAGE 겔에 로드하고 염료가 젤 바닥에 도달할 때까지 약 120 분 동안 겔을 80 볼트에서 실행합니다.

전기영동이 끝나면 겔 장치를 분리하고 젤을 반건식 전사 완충액에 5분 동안 옮깁니다. 그런 다음 PVDF 멤브레인을 메탄올로 채워진 다른 용기에 1분 동안 담가둡니다.

메탄올에서 PVDF 멤브레인을 제거하고 반건식 전사 완충액에 담가둡