SUMOylation Assay: 면역블로팅을 통해 기질 단백질의 SUMOylation 상태를 검출하는 In vitro 기술

SUMOylation은 작은 유비퀴틴 유사 변형제인 SUMO가 기질 단백질에 부착되어 발생합니다.

SUMOylation은 성숙한 SUMO 펩타이드가 효소인 E1에 의해 활성화될 때 발생합니다. 활성화 시 SUMO는 접합 효소(E2)의 활성 부위로 전달되어 SUMO를 기질 단백질의 라이신 잔기에 부착합니다. 또 다른 리가아제인 E3는 이 상호 작용의 효율성을 향상시킵니다.

시험관 내 SUMOylation 분석을 수행하려면 기질 단백질인 p53, 효소 및 SUMO 펩타이드의 혼합물이 들어 있는 튜브로 시작하여 SUMOylation을 유도하기 위해 배양합니다. SDS 함유 완충액인 도데실 황산나트륨으로 튜브를 보충하여 반응을 종료합니다. 단백질을 변성시키기 위해 샘플을 가열합니다.

단백질 혼합물을 SDS-PAGE 겔의 웰에 로드하고 전기영동을 수행합니다. 분자량이 높은 SUMOylated 단백질은 SUMOylated가 아닌 변이체보다 느리게 이동하여 두 개의 별개의 밴드를 생성합니다.

전기 블로팅 장치의 젖은 여과지 위에 있는 블로팅 멤브레인에 젤을 옮깁니다. 젖은 여과지로 덮고 젤에서 멤브레인으로 단백질을 전기 전사합니다.

p53에 결합하는 항-p53 항체로 막을 처리합니다. 항체-p53 복합체에 결합하는 효소 접합 2차 항체와 오버레이. 화학발광 기판을 추가하여 발광 제품을 생성하고 멤브레인을 이미지화합니다.

더 높은 분자량 밴드는 SUMO일화된 단백질에 해당하고, 더 낮은 밴드는 비-SUMO일화된 단백질 변이체에 해당합니다.

시험관 내 SUMOylation 마스터 믹스 반응에서 정제된 tag-K-bZIP 마이크로리터당 100나노그램 3마이크로리터를 첨가합니다. 그런 다음 마스터 믹스의 내용물을 부드럽게 혼합하고 섭씨 30도에서 3시간 동안 배양합니다.

다음으로, 로딩 버퍼와 함께 20마이크로리터의 2x SDS-PAGE를 첨가하여 반응을 중지합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 95도에서 5분 동안 가열하여 단백질을 변성시킵니다.

다음으로, 20 마이크로리터의 샘플을 10% SDS-PAGE 겔에 로드하고 염료가 젤 바닥에 도달할 때까지 약 120 분 동안 겔을 80 볼트에서 실행합니다.

전기영동이 끝나면 겔 장치를 분리하고 젤을 반건식 전사 완충액에 5분 동안 옮깁니다. 그런 다음 PVDF 멤브레인을 메탄올로 채워진 다른 용기에 1분 동안 담가둡니다.

메탄올에서 PVDF 멤브레인을 제거하고 반건식 전사 완충액에 담가둡니다. 그런 다음 멤브레인을 5분 동안 부드럽게 저어줍니다.

반건식 전기영동 장치의 안전 덮개를 제거합니다. 여과지를 미리 적시고 백금 양극 바닥에 젤 샌드위치를 준비합니다. 음극판을 안전 커버에 고정한 후 블롯을 15볼트 정전류로 90분 동안 실행합니다. 그런 다음 세미 건식 장치를 분리한 후 전원 공급 장치를 끄고 PVDF 멤브레인을 꺼냅니다.

이제 분당 30회전의 궤도 셰이커에서 실온에서 1시간 동안 차단 완충액으로 PVDF 멤브레인을 차단합니다. 다음으로, 분당 30회전의 현탁액 믹서에서 12-16시간 동안 섭씨 4도에서 12-16시간 동안 PVDF 멤브레인을 항-p53 항체 및 차단 완충액과 혼성화합니다.

그런 다음 PVDF 멤브레인을 꺼내고 Tween-20과 함께 TRIS 완충 식염수로 채워진 용기에 옮깁니다. 다음으로, PVDF 멤브레인을 Tween-20과 함께 TRIS 완충 식염수에 분당 45회전으로 30분 동안 담그십시오. 그런 다음 PVDF 멤브레인을 차단 완충액에 희석된 양 고추냉이 과산화효소와 접합된 항토끼 항체와 교배하고, 현탁 믹서에서 실온에서 분당 30회전으로 1시간 동안 혼성화합니다.

다음으로, PVDF 멤브레인을 TRIS 완충 식염수로 Tween-20과 함께 세 번 세척합니다. 세척 후, PVDF 멤브레인을 TRIS 완충 식염수 Tween-20에 분당 45회전으로 현탁 믹서에서 30분 동안 담그십시오. 그런 다음 TRIS 완충 식염수 Tween-20을 인산염 완충 식염수로 교체하여 PVDF 멤브레인을 섭씨 4도에서 최대 12시간 동안 보존합니다.

다음으로, 강화된 화학발광 기질 시약 1과 2를 1:1 비율로 혼합합니다. 그런 다음 인산염 완충 식염수에서 PVDF 멤브레인을 제거하고 펀치 포켓으로 잠깐 블링하여 과도한 수분을 흡수합니다.

즉시 400마이크로리터의 화학발광 시약을 멤브레인 표면에 넣고 3-5분 동안 기다립니다. 과도한 화학발광 시약을 배출하기 위해 잠시 블롯하여 멤브레인이 완전히 건조되는 것을 방지합니다. 발광 이미징 시스템을 사용하여 얼룩을 노출시킵니다.