Luciferase Assay: 엔지니어링된 Nanoluciferase 시스템 기반 바이오리포터를 사용하여 발광 신호를 측정하는 고처리량 분석

루시페라제는 기질을 산화시켜 생물발광 산물을 형성하는 효소입니다.

루시페라아제의 이러한 특성은 효소의 분할 버전이 사용되는 나노루시페라제 기반 리포터 시스템을 설계하는 데 도움이 됩니다. 이 시스템에서 더 작은 단편과 더 큰 단편은 서로에 대해 높은 결합 친화력을 가지며 기능성 효소를 재구성할 수 있습니다.

표적 단백질(SARS-CoV-2 스파이크 당단백질의 수용체 결합 도메인)을 검출하기 위해 나노루시페라제 기반 시스템을 사용하려면 부착 세포가 포함된 배양 접시부터 시작합니다. 이 세포는 조작된 나노루시페라아제의 더 작은 단편에 대한 서열 특이적 서열과 함께 표적 단백질을 암호화하는 플라스미드를 포함합니다.

발현 시 배양된 세포는 루시페라아제의 더 작은 단편과 융합된 재조합 표적 단백질인 바이오리포터를 생성합니다. 세포를 용해 완충액으로 처리하고 교반하면서 배양합니다. 완충액 성분은 세포를 빠르게 용해하여 바이오리포터를 포함한 세포 내용물을 상청액으로 방출합니다.

상청액을 멀티웰 분석 플레이트로 옮깁니다. 분할된 나노루시페라아제의 큰 조각을 포함하는 용액으로 각 웰을 보충하고 배양합니다.

배양하는 동안 큰 단편은 바이오리포터의 작은 서브유닛과 자발적으로 결합하여 기능적 형태를 달성합니다. 기질인 furimazine을 함유한 용액을 추가하고 분석 플레이트를 발광계에 놓습니다.

기능성 효소는 푸리마진을 산화시켜 밝은 발광 신호를 방출합니다. 신호의 크기는 표적 단백질 농도와 상관관계가 있습니다.

루시페라아제 분석을 사용하여 바이오리포터로부터의 발광 신호를 평가하려면 먼저 반응 성분을 준비하고 상청액을 바이오리포터의 공급원으로 사용합니다.

사용하기 전에 LgBiT와 기질을 1배로 희석하십시오. 각 웰 또는 튜브에서 50마이크로리터의 상청액을 96웰 플레이트로 옮기고 각 웰에 50마이크로리터의 1x LgBiT를 추가합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.

발광계 소프트웨어를 엽니다. 각 웰에 50마이크로리터의 1x 기질을 추가합니다. 플레이트를 발광계에 놓고 소프트웨어를 실행합니다.