세포 기반 AAV 중화 항체 분석: 혈청 내 특정 아데노 관련 바이러스에 대한 중화 항체를 검출하는 비색 기법

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조합 아데노 관련 바이러스, rAAV, 유전자 조작, 외피가 없는 단일 가닥 DNA 바이러스는 유망한 치료 유전자 운반체입니다.

rAAV는 표적 세포막 수용체에 부착하고 클라트린 매개 엔도사이토시스를 거쳐 rAAV 게놈의 핵 전달 및 치료용 유전자 발현을 촉진합니다. 그러나 rAAV에 대한 중화 면역계 항체는 특정 rAAV 에피토프에 결합하여 세포막 결합, 세포 진입 및 유전자 전달을 방해합니다.

양 혈청에서 특정 rAAV에 대한 중화 항체를 검출하려면 먼저 적절한 농도의 희석된 혈청을 얻습니다. 인간 태반 알칼리성 포스파타제, hPLAP, 유전자를 발현하는 재조합 AAV를 추가합니다. 중화 항체가 AAV에 결합하고 중화되도록 합니다.

이 혼합물을 부착된 인간 상피 세포 배양물을 포함하는 멀티웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 배양 시 AAV는 세포 엔도사이토시스를 겪습니다. 형질도입된 세포는 세포막 결합 hPLAP를 발현합니다. 그러나 중화된 AAV는 세포에 들어갈 수 없습니다.

우물에서 배지를 버리십시오. 파라포름알데히드를 사용하여 세포를 고정합니다. 예열된 완충액을 첨가하고 세포를 가열하여 내인성 세포 알칼리성 포스파타제를 비활성화합니다. hPLAP은 열 비활성화에 강합니다.

hPLAP 기질인 브로모클로로인돌릴 인산염, BCIP 및 니트로 블루 테트라졸륨, NBT를 추가합니다. hPLAP는 이량체화를 거치는 BCIP를 탈인산화하여 파란색 중간체를 형성합니다. 방출된 수소 이온은 NBT를 환원시켜 불용성 보라색 침전물을 생성합니다. 형질도입된 세포를 둘러싼 보라색 침전물을 관찰하는 이미지.

보라색 영역의 비율이 낮을수록 AAV 중화 항체의 농도가 증가했음을 나타냅니다.

예

열된 완전 DMEM 배지에서 세포를 1 x 10 5 cells/mL의 농도로 희석하여 첫날에 HT1080 세포 도장을 시작합니다.

그런 다음 웰당 100마이크로리터의 세포를 투명한 96웰 평평한 바닥 플레이트에 웰당 1 x 10⁴ 세포의 농도로 시드합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 밤새 16-22시간 동안 배양합니다.

둘째 날, 예열된 완전 DMEM을 사용하여 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브에서 관심 있는 혈청 샘플의 연속 희석액을 생성합니다.

희

석된 혈청 샘플이 있는 각 튜브에 마이크로리터 바이러스 작업 용액당 66마이크로리터의 7.5 x 10⁶ 바이러스 게놈을 추가합니다. 피펫팅으로 바이러스/혈청 희석액을 혼합한