Bacterial Co-Incubation Assay: 단일 세포 수준에서 특이성 내 박테리아 경쟁을 시각화하기 위한 형광 현미경 기반 기술

두 박테리아 균주 간의 종내 경쟁으로 인해 억제제 균주가 표적 집단을 죽이는 독성 이펙터 분자를 방출하게 됩니다.

두 개의 그람 음성 박테리아 균주 간의 경쟁적 상호 작용을 시각화하려면 억제제와 표적 균주를 동일한 양으로 포함하는 공동 배양으로 시작합니다.

두 균주 모두 이미징 중에 시각적으로 구별하기 위해 서로 다른 색상의 형광 단백질을 발현하도록 설계되었습니다. 박테리아 균주 간의 세포 간 접촉을 최대화하기 위해 배양액을 농축합니다. 접시 바닥에 놓인 커버슬립에 혼합 배양액을 발견합니다.

굳어진 아가로스 패드를 그 부위 위에 놓아 박테리아가 고정되도록 하고 다른 커버슬립으로 덮습니다. 박테리아 밀집 조건을 시뮬레이션하여 박테리아 성장을 허용하도록 배양합니다.

억제 균주의 세포 외피에는 특수한 분비 시스템인 6형 분비 시스템 또는 T6SS가 포함되어 있습니다. 이는 멤브레인 복합체, 베이스플레이트 및 수축 칼집으로 둘러싸인 내부 튜브로 구성됩니다.

접촉을 감지하면 억제제 균주는 T6SS를 활성화하여 칼집의 수축과 튜브의 배출을 유발하여 궁극적으로 표적 박테리아 세포막의 천공을 초래합니다. 이는 이펙터 분자가 표적 박테리아로 전달되는 것을 촉진하여 사멸로 이어집니다.

형광 현미경을 사용하여 서로 다른 형광을 발하는 박테리아 균주를 식별하는 이미지. 표적 박테리아의 둥근 형태와 그 수의 감소는 억제제 박테리아에 의한 성공적인 사멸을 확인합니다.

모든 샘플에 대해 600나노미터에서 광학 밀도를 측정하고 기록합니다. LBS 배지로 배양액을 희석하여 각 샘플을 광학 밀도 1로 정규화합니다.

라벨이 붙은 1.5밀리리터 튜브에 정규화된 각 균주 30마이크로리터를 첨가하여 동일한 비율로 두 경쟁 균주를 혼합합니다. 혼합 균주 배양액을 1-2초 동안 소용돌이치게 합니다. 각 생물학적 복제 및 처리에 대해 경쟁 균주를 혼합하여 총 4개의 혼합 균주 튜브를 생성합니다.

원심분리를 통해 각 혼합 배양액을 3배 농축하여 공동 배양 중 접촉 의존적 사멸을 위해 충분히 조밀한 경쟁 세포를 보장합니다. 상청액을 버리십시오. 각 펠릿과 20마이크로리터의 LBS 배지를 재현탁하고 각 샘플에 대해 농축 절차를 수행합니다.

도립 현미경으로 이미징하는 경우 35mm 페트리 접시의 #1.5 커버슬립 바닥에 혼합 배양물 2마이크로리터를 발견하고 아가로스 패드를 공동 배양 지점 위에 놓습니다. 아가로스 패드 위에 12mm 원형 유리 커버슬립을 놓습니다