Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay: 단백질-단백질 상호작용을 억제하는 소분자를 스크리닝하기 위한 비드 기반 근접 Assay입니다.

생물학적 시스템에서 단백질과 특정 파트너의 근접성은 성공적인 단백질-단백질 상호 작용의 중요한 결정 요인입니다. 작은 억제 분자가 존재하면 이러한 단백질은 서로 가까이 이동할 수 없어 상호 작용을 방해합니다.

샤페론과 공동 샤페론 사이의 상호 작용을 방해하는 억제 분자를 스크리닝하려면 다양한 소분자가 포함된 멀티웰 플레이트를 사용합니다. 표면에 공동 샤페론이 부착된 기증자 구슬로 우물을 보완합니다. 이 비드에는 화학발광 분석을 위한 감광제가 포함되어 있습니다.

공동 샤페론에 특이적으로 결합하는 샤페론 유래 펩타이드 서열에 접합된 수용체 비드의 슬러리를 추가합니다. 비드에는 시각화에 필수적인 티옥센 기반 염료와 형광단이 포함되어 있습니다.

비억제성 분자가 있는 웰에서는 샤페론 결합 펩타이드와 공동 샤페론 사이의 높은 친화력이 수용체 및 기증자 비드를 끌어당깁니다. 억제제가 존재할 때 구슬은 멀리 떨어져 있습니다.

화학발광 판독기를 사용하여 상호 작용을 연구하십시오. 특정 파장으로 조명되면 기증자 비드 감광제는 반응성이 높은 일중항 산소를 방출합니다.

억제 분자가 없으면 방출된 종은 근위부에 위치한 수용체 비드 근처에 도달하여 염료 분자와 반응하여 화학발광을 일으킵니다. 이 에너지는 수용체 비드의 형광단을 활성화하여 빛 방출을 유발합니다.

대조적으로, 억제 분자가 있는 우물에서는 일중항 산소가 붕괴되어 발광이 발생하지 않아 단백질-단백질 상호 작용이 성공적으로 억제되었음을 나타냅니다.

PBS에 밀리리터당 10마이크로그램 농도의 글루타티온 기증자 비드를 첨가합니다. GST-FKBP51을 밀리리터당 10마이크로그램의 최종 농도로 첨가하고 어두운 곳에서 섭씨 25도에서 10분 동안 반응을 배양합니다.

DMSO에서 테스트 화합물을 연속적으로 희석합니다. 0.25마이크로리터의 테스트 화합물 희석액을 384웰 플레이트의 각 웰 모서리에 세 번씩 추가합니다.

음성 대조군의 경우 0.25마이크로리터의 DMSO를 추가하고, 양성 대조군의 경우 웰에 0.25마이크로리터의 Hsp90 C-말단 펩타이드를 추가합니다.

GST 태그가 부착된 단백질이 포함된 글루타티온 기증자 비드를 함유한 용액 22.5마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. 접시를 손으로 완전히 흔들고 섭씨 25도의 어두운 곳에서 15분 동안 배양합니다.

부착된 Hsp90 C-말단 펩타이드로 수용체 비드를 0.5x PBS에서 밀리리터당 100마이크로그램 농도로 희석합니다. 각 웰에 2.25마이크로리터의 희석된 수용체 비드를 추가합니다. 그림과 같이 플레이트를 흔들어 어두운 곳에서 15분 동안 배양합니다.

플레이트 리더 기기를 켜고 플레이트의 신호를 측정하고 텍스트 원고에 설명된 대로 데이터를 분석합니다.