0 조회수 • 3:43 분 • July 8th, 2025
시작하려면 외피 감염성 바이러스인 단순 포진 바이러스의 연속 희석액을 완충액에 준비합니다.
바이러스에 감수성 상피 세포 배양의 단층을 포함하는 멀티웰 플레이트를 얻습니다. 특정 부피의 배지를 희석된 바이러스 현탁액으로 대체하여 균일한 단층 적용 범위를 보장합니다. 바이러스가 세포 표면에 흡착되도록 합니다.
흡착되지 않은 바이러스를 제거합니다. 세포 단층을 메틸셀룰로오스 함유 배지로 덮어 반고체 오버레이를 형성합니다.
배양 시 바이러스 외피와 세포막이 융합되어 이중 가닥 게놈을 둘러싸고 있는 바이러스 뉴클레오캡시드를 세포질로 방출합니다. 또한 바이러스 게놈은 세포핵으로 방출됩니다.
숙주의 세포 기계와 비리온 단백질을 사용하여 바이러스 게놈은 초기 유전자의 발현을 조절하는 즉각적인 초기 바이러스 단백질을 발현합니다. 초기 바이러스 단백질은 바이러스 DNA 복제를 매개합니다.
그런 다음 후기 바이러스 유전자는 구조 단백질을 발현하며, 이는 바이러스 게놈과 함께 조립되어 자손 비리온 입자를 생성합니다. 바이러스에 감염된 세포는 용해되어 비리온을 방출합니다.
메틸셀룰로오스는 바이러스의 이동을 제한하여 비리온이 인접한 세포에만 감염되고 그에 따른 용해를 일으켜 단층에 구멍을 만듭니다.
배양 후 메틸셀룰로오스 오버레이를 제거합니다. 에탄올 크리스탈 바이올렛 용액을 첨가합니다. 에탄올은 세포를 고정하고 바이러스를 비활성화하는 반면, 크리스탈 바이올렛은 세포를 염색합니다. 결과적으로 보라색 세포 단층에 투명한 용해 영역 또는 플라크가 나타납니다.
감염성 바이러스 역가 또는 농도를 결정하기 위해 각 바이러스 희석에서 각 웰의 플라크를 계산합니다.
피펫을 사용하여 하나 또는 두 개의 웰에서 세포 배양 배지를 제거합니다. 조심스럽게 희석된 바이러스 샘플을 세포의 각 단층에 적금가, 각 웰의 측면을 통해 적방 단위로 추가합니다.
전체 플레이트가 플라크되는 바이러스 샘플로 채워질 때까지 1개 또는 2개의 웰마다 이 과정을 반복합니다. 접시 전체를 손으로 부드럽게 흔듭니다.
그런 다음 플레이트를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양하여 바이러스가 흡착될 수 있도록 합니다. 10분마다 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 다시 부드럽게 흔들어 각 웰에 바이러스를 더 고르게 퍼뜨린 다음 인큐베이터에 다시 넣습니다.
실수로 흡수되지 않은 접종물을 계산할 가능성을 줄이려면 1,000마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 웰에서 바이러스 샘플을 제거하고 샘플을 폐기물 비커에 버립니다.
2.5밀리리터의 메틸셀룰로오스 오버레이를 접시에 놓고 인큐베이터에 다시 넣습니다. 생물 안전 캐비닛에서 제거하기 전에 일반적으로 표백제, 요오도포어 또는 유사한 살바이러스제를 첨가하여 폐기물 비커를 소독하십시오.
2일간의 배양 후 피펫을 사용하여 한 번에 한두 개의 웰에서 메틸셀룰로오스 오버레이를 제거하고 폐기물 비커에 넣습니다. 각 웰에 약 2밀리리터의 1% 크리스탈 바이올렛과 50% 에탄올을 첨가합니다. 얼룩으로 채워진 모든 웰과 함께 플레이트를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.
이 시점에서 이전에 설명한 대로 폐기물 비커를 소독합니다. 유출수가 깨끗해질 때까지 수돗물로 접시를
세게 씻으십시오.각 희석 시리즈에서 플라크 수에 약 10배의 차이가 있는지 확인하십시오.