Terminal Transferase-Mediated dUTP Nick End-Labeling—TUNEL Assay: An In Situ Method to Detect DNA Fragmentation in apoptotic cells(말단 전이효소 매개 dUTP 닉 말단 라벨링—TUNEL 분석법: 세포사멸 세포에서 DNA 단편화를 검출하는 현장 방법)

미생물 병원체에 감염된 숙주 세포는 세포사멸(프로그램된 세포 사멸)을 겪습니다. 세포사멸 동안 DNase는 염색체 DNA를 작은 조각으로 분해하여 세포 사멸을 초래합니다.

TUNEL 분석을 사용하여 세포사멸을 검출하려면 진균 병원체에 감염된 탈라핀화 및 재수화된 피부 조직 절편이 있는 유리 슬라이드를 채취합니다.

조직을 프로테이나제-K로 처리하여 세포 DNase를 비활성화하여 분석 중에 잠재적으로 DNA를 분해하는 것을 방지합니다. 과산화수소를 첨가하여 반응을 담금질하고 슬라이드를 세척하여 미반응 프로테이나제-K를 제거합니다.

디옥시게닌 표지 데옥시-우리딘 삼인산염 또는 dUTP를 포함하는 완충액을 추가합니다. 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제, TdT 효소를 보충하고 배양합니다. 세포사멸 세포에서 TdT 효소는 단편화된 DNA의 노출된 3'-수산기에 표지된 dUTP의 부착을 촉매합니다.

다음으로, 로다민 리포터에 접합된 항-디곡시게닌 항체를 추가하고 어두운 곳에서 배양하여 디곡시게닌 표지 dUTP에 대한 항체 결합을 촉진하여 이미징 시 적색 형광을 부여합니다.

핵을 시각화하기 위해 형광 핵 대조 염색으로 조직 샘플을 처리합니다. 조직 절편 위에 커버슬립을 놓고 형광 현미경으로 시각화합니다.

파란색 형광은 조직 절편에 있는 모든 세포의 핵을 식별하는 데 도움이 되는 반면, 로다민으로 염색된 세포에 적색 형광이 존재하면 세포사멸로 인한 DNA 단편화를 나타냅니다.

이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플 조직으로 친수성 유리 슬라이드를 준비합니다.

조직 절편을 탈파라핀화하려면 슬라이드를 코플린 용기에서 자일렌으로 각각 5분 동안 세 번 세척합니다. 그런 다음 슬라이드를 100% 에탄올로 각각 5분 동안 두 번 세척합니다. 그 후, 슬라이드를 95% 에탄올, 70% 에탄올로 각각 3분간 세척한 후 PBS로 5분간 한 번 세척한다.

실험 및 음성 대조군 슬라이드를 준비하려면 새로 희석된 Proteinase K를 슬라이드에 직접 추가하여 조직을 전처리합니다. 슬라이드를 실온에서 10분 동안 배양한 다음 슬라이드를 PBS에서 각각 2분 동안 두 번 세척합니다.

양성 대조군 슬라이드를 준비하려면 조직을 DN 완충액으로 전처리한 다음 슬라이드를 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그 후, DNase I을 DN 완충액에 밀리리터당 0.1마이크로그램의 최종 농도로 용해시켰다. 준비된 DNA 용액을 슬라이드에 추가합니다. 슬라이드를 실온에서 15분 동안 배양한 다음 코플린 병에 증류수로 측면을 각각 3분 동안 5회 세척합니다.

PBS의 3% 과산화수소에서 실온에서 5분 동안 반응을 담금질합니다. 그런 다음 슬라이드를 PBS에서 각각 2분 동안 두 번 세척합니다. 그런 다음 슬라이드의 조직에 평형 완충액을 추가합니다. 실온에서 10초 동안 배양한 다음 조직 절편 주변의 여분의 액체를 두드려 제거합니다.

반응 완충액에 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 효소를 희석한 다음 실험 및 양성 대조군 슬라이드의 조직에 첨가합니다. 섭씨 37도에서 가습실에서 1시간 동안 배양합니다.

그런 다음 정지 완충액의 작동 농도가 들어 있는 코플린 용기에 슬라이드를 넣습니다. 15초 동안 교반한 다음 슬라이드를 실온에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 슬라이드를 PBS로 각각 1분 동안 세 번 세척하고 여분의 액체를 두드려냅니다.

다음으로, 실온으로 예열된 항디곡시게닌 접합체를 조직에 직접 첨가합니다. 가습된 어두운 챔버에서 실온에서 슬라이드를 30분 동안 배양합니다.

배양이 완료된 후 슬라이드를 PBS로 각각 2분 동안 4회 세척합니다. 여분의 액체를 두드려 버립니다. 그런 다음 측면에 장착 매체를 추가합니다. 슬라이드의 마운팅 매체에 15마이크로리터의 DAPI 용액을 추가합니다. 각 슬라이드를 커버슬립으로 덮고 매니큐어로 밀봉합니다. 슬라이드를 어둠 속에서 건조시키십시오.

형광 현미경을 사용하여 염색 과정이 완료되는 즉시 슬라이드를 관찰합니다.

각 피부 섹션을 따라 무작위 간격으로 400회 사진을 찍습니다. DAPI 염색 청색 세포를 계수하여 동물당 피부 절편당 최소 100개의 세포가 보이는지 확인합니다. 다음으로, 세포 가장자리가 명확한 빨간색 단일 세포로 나타나는 TUNEL 양성 세포의 수를 계산합니다.