0 조회수 • 2:54 분 • July 8th, 2025
카스파제-3 및 카스파제-7은 표적 단백질의 DEVD 테트라펩타이드 서열을 인식하여 아스파르트산 잔기의 C-말단에서 절단하는 프로테아제입니다. 이들은 세포사멸(프로그램된 세포 사멸)
에서 중요한 역할을 합니다.세포사멸 세포에서 카스파제-3/7 활성을 평가하려면 세포사멸 유도 진균에 감염된 개구리 발가락 피부 외식편이 들어 있는 튜브로 시작합니다. 튜브에 적절한 완충액과 몇 개의 금속 비드를 추가합니다.
비드 비트를 사용하여 피부 세포를 파괴하고 카스파제-3/7 단백질을 포함한 세포 내용물을 방출합니다. 튜브를 원심분리하여 세포 파편과 소기관을 펠릿화합니다. 튜브에서 단백질이 풍부한 상청액을 흡인하고 멀티웰 분석 플레이트의 웰에 피펫을 넣습니다.
루미노제닉 카스파제 시약으로 웰을 보충합니다. 이 시약은 ATP, 마그네슘 이온 및 루시페라아제 효소를 함유한 완충 용액에 DEVD 펩타이드를 포함하는 발광 기질로 구성됩니다.
우물의 내용물을 섞고 배양하십시오. 배양하는 동안 카스파제-3/7은 발광 기질을 절단하여 루시페라아제의 기질인 아미놀루시페린을 용액으로 방출합니다.
ATP와 마그네슘 이온이 있는 상태에서 루시페라아제는 방출된 아미놀루시페린을 산화시켜 생물발광 생성물을 생성합니다. 반응 중에 생성되는 빛의 양은 카스파제 활성에 비례합니다.
냉동 개구리 발가락 샘플에서 단백질을 추출하려면 100마이크로리터의 샘플 완충액과 2개의 스테인리스 스틸 비드가 들어 있는 1.5밀리리터 스크류 캡 미세 원심분리기 튜브에 샘플을 넣습니다.
비드 비터를 최대 속도로 사용하여 세포를 용해합니다. 그런 다음 튜브를 얼음 위에 3분 동안 놓은 다음 튜브를 원심분리하여 상청액을 수집합니다.
384웰 플레이트에서 카스파제 3/7 분석을 수행하려면 10마이크로리터의 샘플 완충액을 블랭크로 추가하고 10마이크로리터의 단백질 추출물을 3회씩 추가합니다. 그런 다음 시중에서 판매되는 카스파제 3/7 시약 10마이크로리터를 단백질 추출물과 블랭크 웰에 피펫팅합니다. 그런 다음 플레이트를 15초 동안 부드럽게 흔들어 두 시약을 혼합합니다.
실온에서 30분 동안 어둡게 배양합니다. 마지막으로 발광판 판독기를 사용하여 샘플의 발광을 측정합니다.