Fixed Cell Efferocytosis Assay: 형광 현미경을 사용하여 대식세포에 의한 세포사멸 세포의 발포성 흡수를 연구하는 방법

세포사멸(프로그램된 세포 사멸)을 겪고 있는 세포는 세포 표면에 먹기 신호를 표시하여 특수한 면역 세포인 식세포에 의한 분해를 촉진합니다. 세포사멸 세포의 이러한 제거 과정을 세포 세포 제거증이라고 합니다.

efferocytosis 분석을 수행하려면 먼저 이중 염색된 세포사멸 세포의 현탁액을 취합니다. 이 세포의 표면은 비오틴으로 표지되고 세포질은 세포 추적 염료로 표지되어 세포사멸 세포 유래 물질에 태그가 붙습니다.

세포 현탁액을 배양세포로 기능하는 부착된 대식세포 세포의 배양물에 첨가합니다. 원심분리하여 대식세포와 세포사멸 세포 사이의 접촉을 강제하고 배양합니다.

대식세포의 에페로스포틱 수용체는 세포사멸 세포막의 포스파티딜세린(먹기 신호)에 결합하여 삼킴을 촉진합니다. 세포사멸 세포의 작은 조각은 발포체라고 하는 막에 결합된 소포 내부에서 흡수됩니다.

그 결과 대식세포 내부의 세포사멸 세포의 일부인 발포세포 분획과 세포사멸 세포의 내재화되지 않은 부분인 비발포세포 분획이 생성됩니다.

형

광 표지 스트렙타비딘을 첨가하여 비발포세포 분획 표면의 노출된 비오틴 분자에 결합하여 세포사멸 세포의 비내재화 부분과 내재화 부분을 구별합니다.

형광 현미경에서 내재화되지 않은 세포사멸 세포 분획은 스트렙타비딘 표지를 나타내는 반면, 에페로솜은 스트렙타비딘이 없는 개별 점으로 나타납니다.

세포 배출증을 정량화하려면 개별 세포 발생 세포질의 수를 결정하고 세포사멸 세포 분획 및 비세포 세포사멸 세포 분획의 강도를 측정합니다.

인간 대식세포와 세포사멸성 Jurkat 세포를 준비한 후 혈구계를 사용하여 세포사멸 세포의 수를 계산합니다. 그런 다음 충분한 양의 세포사멸 세포를 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

5

분 동안 500배 g에서 원심분리를 통해 Jurkat 세포를 펠릿화합니다. 그런 다음 세포를 500마이크로리터의 PBS에 재현탁합니다. Jurkat 세포가 원심분리기에 있는 동안 10마이크로리터의 DMSO를 새로운 미세 원심분리기 튜브에 분취합니다.

다음으로, DMSO에 최소량의 NHS-비오틴을 용해시킵니다. 그 후, 500마이크로리터의 세포사멸 세포와 PBS 현탁액을 DMSO 및 NHS-비오틴이 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 적절한 세포 추적 염료를 희석합니다.

세포 현탁액을 실온에서 어두운 곳에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 동일한 부피의 RPMI 1640을 10% FB