JoVE 실험 백과사전
생물학적 기술
0 조회수 • 7:16 분 • July 8th, 2025
감수 분열의 prophase-I에 있는 난모세포는 전사적으로 활성입니다. 그들은 mRNA를 생성하고 휴면 형태로 저장합니다. 성숙하는 동안 난모세포가 중기에 들어가면서 저장된 mRNA는 단백질로 번역됩니다.
mRNA의 번역을 연구하기 위해, 한 방울의 배지에 현탁된 prophase-I-정지 마우스 난모세포로 시작하십시오. 홀딩 피펫을 단일 난모세포 근처에 배치하여 제자리에 고정합니다.
리포터 믹스가 들어 있는 마이크로 주입 피펫을 가져 가십시오. 이 혼합물에는 두 가지 유형의 mRNA, 하나는 노란색 형광 단백질 또는 YFP(표적 유전자의 3'-비번역 영역과 융합된 리포터)와 적색 형광 단백질을 암호화하는 폴리아데닐화 mRNA를
포함합니다.리포터 믹스를 난모세포에 주입합니다. 미세 주입된 난모세포를 실로스타마이드(prophase-I 정지를 유지하는 화학 억제제)가 보충된 성숙 배지에서 배양합니다.
난모세포는 적색 형광 강도가 정체기에 도달할 때까지 폴리아데닐화된 mRNA를 번역하는 반면, 폴리아데닐화 꼬리가 없는 YFP 암호화 mRNA의 수준은 그대로 유지됩니다.
처리된 난모세포를 감수분열을 재개하는 데 도움이 되는 실로스타마이드가 없는 성숙 배지로 옮기고; 표적 mRNA는 번역을 거쳐 황색 형광 리포터와 융합된 표적 단백질을 생성합니다.
타임랩스 이미징을 수행하여 일정한 간격으로 형광 신호를 시각화합니다.
주입된 난모세포는 일정한 수준의 적색 형광을 나타내는 반면, 노란색 형광은 시간이 지남에 따라 증가하여 리포터 단백질의 번역 및 점진적인 축적을 나타냅니다.
시작하려면 26게이지 바늘로 모낭 벽에 작은 절단을 하여 전정부 모낭을 조심스럽게 엽니다. 입으로 작동되는 유리 피펫을 사용하여 여러 층의 난구 세포로 손상되지 않은 COC를 분리합니다. 더 작은 피펫을 사용하고 반복적인 피펫팅을 통해 COC를 기계적으로 제거하십시오.
벗겨진 난모세포를 흡인하고 실로스타미드 1마이크로몰이 보충된 성숙 배지가 있는 페트리 접시에 넣습니다. 접시를 인큐베이터에 2시간 동안 넣어 난모세포가 난포에서 분리되어 유발된 스트레스에서 회복되도록 합니다.
10cm 길이의 붕규산 유리 모세관과 기계식 풀러를 놓아 주사 바늘을 준비합니다. 최적의 주입을 위해 가열된 필라멘트를 사용하여 바늘 끝을 45도 각도로 구부립니다. 폴리스티렌 접시에 20마이크로리터의 기본 난자 수집 배지 방울을 넣고 가벼운 미네랄 오일로 물방울을 덮습니다.
Ypet UTR 및 mCherry의 마이크로리터당 각각 12.5마이크로그램을 첨가하여 더 많은 양의 리포터 혼합물을 준비합니다. 이들의 분취량을 섭씨 영하 80도에 보관하십시오. 해동 후 분취량을 20,000 x g으로 2분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 새 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
주사 바늘에 약 0.5마이크로리터의 리포터 믹스를 넣습니다. 홀딩 피펫과 주사 바늘을 홀더에 넣고 난자 수집 배지의 물방울에 놓습니다.
주사 바늘을 고정 피펫에 부드럽게 두드려 엽니다. 염기성 수집 배지의 방울에 난모세포를 넣고 리포터 혼합물의 5-10 피코리터를 주입합니다. mCherry 신호가 정체될 수 있도록 성숙 배지에서 1마이크로몰 실로스타마이드와 함께 16시간 동안 난모세포를 배양합니다.
타임랩스 현미경 검사의 경우, 주입된 각 리포터에 대해 20마이크로리터의 성숙 배지 방울 2개가 있는 페트리 접시를 준비합니다. 대조군 prophase-I 정지 난모세포를 위한 1마이크로몰 실로스타마이드가 있는 물방울 1개와 성숙 난모세포를 위한 실로스타마이드가 없는 물방울 1개. 물방울을 가벼운 미네랄 오일로 덮고 인큐베이터에 넣으십시오.
사전 배양 후, 주입된 난모세포를 인큐베이터에서 제거하고 실로스타마이드가 없는 성숙 배지에서 4회 세척합니다. 일부 난모세포를 1마이크로몰 실로스타마이드가 있는 성숙 배지에 prophase-I 난모세포 대조군으로 보관합니다.
주입된 난모세포를 미리 준비된 타임랩스 현미경 접시의 각각의 물방울로 옮깁니다. 기록 중 난모세포의 움직임을 방지하기 위해 닫힌 유리 피펫으로 난모세포를 클러스터
링합니다.텍스트 원고에 언급된 매개변수를 사용하여 발광 다이오드 조명 시스템이 장착된 현미경과 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%로 유지되는 환경 챔버가 장착된 전동 스테이지 아래에 접시를 놓습니다.
"앱"을 클릭한 다음 "다차원 획득"을 클릭하여 타임랩스 실험에 대한 적절한 설정을 입력합니다. 첫 번째 탭인 "메인"을 선택하고 "타임랩스", "여러 스테이지 위치" 및 "여러 파장"을 선택합니다.
탭을 선택합니다 "저장" 실험을 저장해야 하는 위치를 입력합니다. 그런 다음 "타임랩스" 탭을 선택하여 시점 수, 지속 시간 및 시간 간격을 입력합니다. "스테이지" 탭을 선택합니다. 명시야를 켜고 새 창을 열고 "획득", "획득" 및 "라이브 표시"를 선택하여 난모세포의 위치를 찾습니다.
난모세포를 찾으면 "다차원 획득 창"으로 다시 전환하고 "+"를 눌러 난모세포의 위치를 설정합니다. "파장" 탭을 선택하고 명시야, YFP 및 mCherry에 대해 세 가지 파장을 설정합니다. Ypet 및 mCherry의 노출을 조정합니다. 그런 다음 "획득"을 클릭하여 타임랩스 실험을 시작합니다.
Ypet-3' UTR 번역을 분석하려면 각 난모세포에 대해 두 개의 영역 측정을 수행합니다. 난모세포 자체는 "타원 영역"을 클리핑하고 난모세포를 둘러싼 작은 영역은 "직사각형 영역"을 클릭하여 배경 빼기에 사용할 것입니다. "로그 열기"를 클릭한 다음 "로그 데이터"를 클릭하여 지역 측정 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.
각 개별 난모세포 및 측정된 모든 시점에 대해 YFP 및 mCherry 파장에 대해 별도로 난모세포 영역 측정에서 배경 영역 측정값을 뺍니다.