In Vitro Single Oocyte Reporter Assay: In Vitro 난모세포 성숙 중 표적 mRNA 번역 조절을 연구하는 기술

감수 분열의 prophase-I에 있는 난모세포는 전사적으로 활성입니다. 그들은 mRNA를 생성하고 휴면 형태로 저장합니다. 성숙하는 동안 난모세포가 중기에 들어가면서 저장된 mRNA는 단백질로 번역됩니다.

mRNA의 번역을 연구하기 위해, 한 방울의 배지에 현탁된 prophase-I-정지 마우스 난모세포로 시작하십시오. 홀딩 피펫을 단일 난모세포 근처에 배치하여 제자리에 고정합니다.

리포터 믹스가 들어 있는 마이크로 주입 피펫을 가져 가십시오. 이 혼합물에는 두 가지 유형의 mRNA, 하나는 노란색 형광 단백질 또는 YFP(표적 유전자의 3'-비번역 영역과 융합된 리포터)와 적색 형광 단백질을 암호화하는 폴리아데닐화 mRNA를

포함합니다.

리포터 믹스를 난모세포에 주입합니다. 미세 주입된 난모세포를 실로스타마이드(prophase-I 정지를 유지하는 화학 억제제)가 보충된 성숙 배지에서 배양합니다.

난모세포는 적색 형광 강도가 정체기에 도달할 때까지 폴리아데닐화된 mRNA를 번역하는 반면, 폴리아데닐화 꼬리가 없는 YFP 암호화 mRNA의 수준은 그대로 유지됩니다.

처리된 난모세포를 감수분열을 재개하는 데 도움이 되는 실로스타마이드가 없는 성숙 배지로 옮기고; 표적 mRNA는 번역을 거쳐 황색 형광 리포터와 융합된 표적 단백질을 생성합니다.

타임랩스 이미징을 수행하여 일정한 간격으로 형광 신호를 시각화합니다.

주입된 난모세포는 일정한 수준의 적색 형광을 나타내는 반면, 노란색 형광은 시간이 지남에 따라 증가하여 리포터 단백질의 번역 및 점진적인 축적을 나타냅니다.

시작하려면 26게이지 바늘로 모낭 벽에 작은 절단을 하여 전정부 모낭을 조심스럽게 엽니다. 입으로 작동되는 유리 피펫을 사용하여 여러 층의 난구 세포로 손상되지 않은 COC를 분리합니다. 더 작은 피펫을 사용하고 반복적인 피펫팅을 통해 COC를 기계적으로 제거하십시오.

벗겨진 난모세포를 흡인하고 실로스타미드 1마이크로몰이 보충된 성숙 배지가 있는 페트리 접시에 넣습니다. 접시를 인큐베이터에 2시간 동안 넣어 난모세포가 난포에서 분리되어 유발된 스트레스에서 회복되도록 합니다.

10cm 길이의 붕규산 유리 모세관과 기계식 풀러를 놓아 주사 바늘을 준비합니다. 최적의 주입을 위해 가열된 필라멘트를 사용하여 바늘 끝을 45도 각도로 구부립니다. 폴리스티렌 접시에 20마이크로리터의 기본 난자 수집 배지 방울을 넣고 가벼운 미네랄 오일로 물방울을 덮습니다.

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