식물 조직의 용해성 단백질 함량을 정량화하기 위한 수용성 단백질 분석

식물 조직의 가용성 단백질 함량을 정량화하려면 튜브에서 적절한 양의 분쇄된 동결건조 식물 조직으로 시작합니다.

알칼리 인 수산화 나트륨을 튜브에 넣고 초음파 처리합니다. 기계적 힘이 있는 알칼리성 환경은 세포를 파괴하여 수용성 단백질 및 탄수화물과 같은 거대분자를 포함한 세포내 내용물을 방출합니다. 더 높은 온도에서 배양하십시오.

열이 있는 상태에서 알칼리는 단백질 가수분해를 일으켜 더 작은 펩타이드를 형성하고 단백질 용해도를 증가시킵니다. 또한 탄수화물이 분해됩니다.

혼합물을 원심분리합니다. 가용화된 단백질 함유 상청액을 수집합니다. pH를 중화시키기 위해 염산을 첨가합니다.

트리

클로로아세트산, TCA로 샘플을 처리합니다. TCA는 단백질을 둘러싼 수화 껍질을 파괴하여 단백질 응집 및 침전을 유발합니다.

TCA 함유 상청액을 원심분리하고 제거합니다. 단백질 펠릿을 얼음처럼 차가운 아세톤으로 세척하여 가용성 단백질 추정을 방해할 수 있는 잔류 TCA를 제거합니다.

아세톤을 자연 건조시킵니다. 단백질 펠릿을 수산화나트륨에 재현탁합니다. 탈이온수로 희석하십시오. 멀티웰 플레이트의 웰로 옮깁니다.

Coomassie Brilliant Blue G-250 염료의 산성 용액을 첨가합니다. 산성 조건에서 염료는 가용화된 단백질의 염기성 아미노산 잔기에 결합하여 파란색 단백질-염료 복합체를 생성합니다.

분광 광도계를 사용하여 식물 조직의 가용성 단백질 함량에 비례하는 단백질-염료 복합체의 흡광도를 측정합니다.

시작하려면 각 조직의 복제 샘플을 라벨이 부착된 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 무게를 잰다. 다음으로 각 샘플의 정확한 질량을 기록합니다. 마이크로 피펫터를 사용하여 각 튜브에 500마이크로리터의 0.1몰 수산화나트륨을 추가합니다. 뚜껑을 단단히 닫고 튜브를 30 분 동안 초음파 처리하십시오.

그런 다음 튜브를 예열된 온수조에 15분 동안 넣습니다. 그런 다음 튜브를 15,000g에서 10분 동안 원심분리 합니다. 각 샘플에 대해 새로운 피펫 팁을 사용하여 상청액을 새로운 표지된 미세 원심분리기 튜브에 피펫팅합니다.

펠

릿에 300마이크로리터의 0.1몰 수산화나트륨을 넣고 10분 동안 원심분리를 반복합니다. 그 후, 상청액을 제거하고 첫 번째 원심분리에서 상청액이 들어 있는 튜브로 옮깁니다.

상청액의 pH를 중화하려면 11마이크로리터의 5.8몰염산을 첨가합니다. 리트머스 종이를 사용하여 pH가 약 7인지 확인합니다.

다음으로, 각 튜브에 90마이크로리터의 100% 트리클로로아세트산을 추가합니다. 그런 다음 튜브를 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 샘플을 섭씨 4도에서 10분 동안 13,000g에서 원심분리합니다. 진공 라인과 유리 마이크로피펫 팁을 조심스럽게 사용하여 트리클로로아세트산을 제거합니다.

흡입 팁으로 펠릿을 방해하지 않도록 각별히 주의하십시오.

다음으로, 섭씨 영하 20도로 냉각된 100마이크로리터의 아세톤으로 펠릿을 세척합니다. 그런 다음 아세톤이 흄 후드에서 증발하도록 합니다. 단백질 펠릿을 수산화나트륨 1밀리리터로 녹입니다. 추가 가열, 소용돌이 및 초음파 처리가 필요할 수 있습니다.

각 IgG 표준 용액 160마이크로리터를 A1 위치부터 시작하여 96웰 플레이트에 3대로 추가합니다. 다음으로, 새로운 1.5밀리리터 튜브에 각 샘플 용액 50마이크로리터를 증류수 950마이크로리터에 첨가합니다. 그런 다음 희석된 각 샘플 60마이크로리터를 H1 위치부터 시작하여 웰 플레이트에 세 번씩 추가합니다. 모든 빈 및 알려지지 않은 샘플 웰에 100마이크로리터의 증류수를 추가합니다.

다중 채널 피펫을 사용하여 플레이트의 각 웰에 40마이크로리터의 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250 단백질 염료를 추가합니다. 바늘을 사용하여 우물에 있는 기포를 터뜨립니다. 그런 다음 플레이트를 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 마이크로플레이트 분광 광도계를 사용하여 595나노미터에서 각 웰의 흡광도 값을 기록합니다.