세포 내 기생충 생식을 정량화하기 위한 Luciferase-based growth assay

단세포 원생동물인 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii)는 숙주 세포 내부에서만 번식하는 절대적인 혐기성 기생충입니다.

루시페라아제 기반 분석을 사용하여 기생충의 세포내 성장을 정량화하려면 기질과 반응하여 발광을 생성하는 효소인 루시페라아제를 발현하는 기생충 세포의 현탁액을 사용합니다. 현탁액을 인간 포피 섬유아세포 배양액에 첨가하고 적절한 기간 동안 배양합니다.

기생충은 숙주 세포 수용체에 결합하고 세포 내세포 과정을 통해 내재화되어 기생 액포를 형성합니다. 이 구조는 기생충이 번식할 수 있는 틈새를 제공합니다.

감염 후 배지를 흡인하여 내재화되지 않은 기생충을 제거합니다. 세제와 루시페라아제의 기질인 루시페린이 포함된 용해 완충액을 추가합니다. 완충액의 세제는 세포막에 기공을 만들고 세포를 완전히 용해시켜 루시페라아제를 방출합니다.

방출된 효소는 루시페린 분자를 산화시켜 빛을 방출합니다. 루시페라아제 활성을 결정하기 위해 발광 강도를 측정합니다. 감염된 숙주 세포를 포함하는 복제 웰을 사용하여 감염 후 미리 결정된 간격으로 루시페라제 활성을 측정합니다.

시간 경과에 따른 기생충 성장의 배수 변화를 얻기 위해 정규화된 발광 강도와 시간 간격을 플로팅합니다. 강도의 시간적 증가는 성공적인 기생충 증식을 나타냅니다.

값을

로그 척도로 플로팅하여 기생충의 배가 시간을 나타내는 곡선의 기울기를 계산합니다.

루시페라아제 기반 톡소플라스마 성장 분석을 수행하려면 먼저 인간 포피 섬유아세포의 사전 파종된 96웰 마이크로플레이트 배양에서 배지를 조심스럽게 흡인하고 150마이크로리터의 기생충 없는 현탁액을 3열, 5행 형식으로 웰에 접종합니다.

세포 배양 인큐베이터에서 4시간 배양한 후, 각 웰에서 배지를 조심스럽게 흡인하여 침입되지 않은 기생충을 제거하고 첫 번째 행을 제외한 각 줄의 웰을 실온의 페놀 레드 프리 배지로 채웁니다. 그런 다음 PBS에 12.5마이크로몰 루시페라제 기질 용액 100마이크로리터를 맨 윗줄의 각 웰에 첨가하고 마이크로플레이트를 실온에서 10분 동안 배양하여 전체 세포 용해를 허용합니다.

배양이 끝나면 마이크로플레이트 리더에서 루시페라아제 활성을 측정합니다. 각 판독값은 감염 후 4시간에 침입한 기생충의 초기 수를 나타냅니다. 배지를 교체하지 않고 다음 4일 동안 24시간마다 분석을 반복합니다.

기생충 성장의 정규화된 배수 변화를 계산하기 위해 각 판독값을 감염 후 4시간의 초기 판독값으로 나눌 수 있습니다. 그런 다음 기생충 성장의 정규화된 배수 변화의 log2를 각 시점에 대해 플로팅하고 선형 회귀 함수를 적용하여 배가 시간을 나타내는 기울기를 얻을 수 있습니다.