기생충에 대한 항기생충 화학물질의 효능을 연구하기 위한 루시페라제 분석

원생동물 기생충인 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii)는 유핵 동물 숙주 세포 내에서만 번식합니다. 그것은 세포 내 세포 과정을 통해 숙주 세포를 침범하여 기생 액포를 형성합니다. 액포 내부에서 기생충은 숙주 세포질 단백질을 섭취하여 성장을 위한 영양분을 획득합니다.

숙주 세포 내부의 기생충에 대한 구충제 화학물질의 효능을 스크리닝하려면 여러 웰에서 인간 포피 섬유아세포의 부착 배양물이 포함된 분석 플레이트를 가져갑니다.

루

시페라아제(발광 생성 효소)를 발현하는 톡소플라스마 기생충을 각 웰에 동일한 양으로 분배합니다. 기생충이 숙주 세포를 침범하고 기생 액포 내부에서 성장할 수 있도록 배양합니다.

배양 후, 배지를 흡인하여 섭취하지 않은 기생충을 제거합니다. 다양한 농도의 시스테인 프로테아제 표적 구충제 화합물로 웰을 보충하고 배양합니다.

약물 분자는 기생충에 도달하기 위해 숙주 세포에 들어갑니다. 일단 내부로 들어가면 약물은 기생충의 시스테인 프로테아제 효소를 억제하여 숙주 결합 기생충의 영양분 획득을 방해하고 성장을 멈

춥니다.

약물 함유 배지를 흡인합니다. 루시페라아제 효소에 특이적인 기질을 포함하는 분석 완충액을 추가합니다. 완충 성분은 세포를 용해시켜 기생충의 루시페라아제 효소가 기질을 산화시켜 밝은 발광을 생성합니다.

모든 화학 억제제 농도에 대한 발광을 측정합니다. 약물 농도가 증가함에 따라 발광 강도가 감소하면 화학 억제제의 구충 효능이 나타납니다.

톡소플라스마 성장에 대한 관심 화합물의 억제 효능을 평가하기 위해, 인간 포피 섬유아세포를 96웰 마이크로플레이트에서 최소 7일 동안 배양한 후 입증된 바와 같이 세포의 각 웰에 150마이크로리터의 기생충을 접종합니다.

배양하는 동안 연속 희석에 의해 12벽 저장소에서 8가지 다른 농도로 관심 화합물을 준비합니다.

12웰 저장소에서 1밀리리터 피펫으로 각 혼합물을 위아래로 여러 번 피펫팅하여 1:1 희석으로 화합물을 희석합니다.

감염 후 4시간에, 컬럼 2 내지 9의 각 웰의 배지를 화합물의 각 희석액으로 보충된 150마이크로리터의 배지로 교체하고, 첫 번째 컬럼은 처리되지 않은 대조군 역할을 하기 위해 일반 배지로 채워진 채로 남겨둡니다. 그런 다음 세포 배양액을 세포 배양 인큐베이터에 96시간 동안 되돌리고 각 웰에 대한 루시페라제 활성을 측정하여 각 농도의 화합물에서 배양액의 성장 억제 비율을 결정합니다.

정규화된 루시페라아제 활성을