잘못 국소화된 TA 단백질의 제거를 연구하기 위한 Msp1 추출 분석

미토콘드리아 외막의 ATPase인 Msp1은 육량체 중앙 기공을 통해 막에서 잘못 국소화된 꼬리 고정(TA) 단백질을 제거하여 분해를 촉진합니다.

전좌의 메커니즘을 이해하기 위해 TA 단백질과 Msp1을 리포좀으로 공동 재구성하여 지질 이중층에 통합할 수 있습니다.

재

구성된 리포좀을 샤페론(세포질 품질 관리 단백질)을 포함하는 적절한 완충액에 첨가하여 반응 혼합물을 준비합니다. 샤페론은 글루타티온-S-트랜스퍼라제 또는 GST 효소로 태그가

지정됩니다.

반응에 아데노신 삼인산(ATP)을 첨가합니다. Msp1은 ATP 분자에 결합하여 가수분해합니다. 가수분해 생성 에너지를 사용하여 Msp1은 중앙 기공을 통해 막에 결합된 TA 단백질을 전위시킵니다. 반응 혼합물의 샤페론은 추출된 TA 단백질의 막관통 도메인에 결합합니다.

그런 다음 반응 혼합물을 친화성 정제 컬럼에 로드합니다. 컬럼에는 환원 글루타티온 또는 GSH와 결합된 수지가 포함되어 있습니다. 샤페론의 GST 단백질은 결합된 GSH(기질)에 결합하여 샤페론-TA 단백질 복합체를 수지에 부착합니다.

컬럼을 돌려 여전히 리포좀에 통합된 TA 단백질을 제거합니다. 이제 과량의 GSH를 포함하는 용출 완충액을 추가합니다. 유리 GSH 분자는 GST와 접합 GSH 사이의 결합을 경쟁적으로 대체합니다.

방출된 샤페론-TA 단백질 복합체를 완충액으로 용리합니다. 용출액을 분석하여 TA 단백질의 존재를 확인하고, 이는 리포좀에서 제거되었음을 나타냅니다.

SDS-PAGE 분석을 위한 튜브를 준비합니다. 입력 튜브에 45마이크로리터의 이중 증류수를, 플로우 스루 튜브에 40마이크로리터의 물을, 각 튜브에 16.6마이크로리터의 4X SDS-PAGE 로딩 버퍼를 추가합니다.

추출 분석의 경우 추출 반응을 준비하고 추출 완충액을 사용하여 최종 부피를 200마이크로리터로 끌어올립니다. 그런 다음 30도 섭씨 열 블록에서 추출 분석을 2분 동안 예열합니다.

분석을 시작하려면 ATP를 최종 농도 2밀리몰까지 첨가합니다. 튜브를 피코푸게에서 5초 동안 회전시키고 섭씨 30도에서 30분 동안 배양합니다.

배양하는 동안 반응의 5마이크로리터 샘플을 채취하여 입력 튜브에 추가합니다. 또한 시연된 바와 같이 추출 분석에서 각 샘플에 대해 하나의 글루타티온 스핀 컬럼을 평형화합니다.

30분 배양이 완료되면 200마이크로리터의 추출 완충액을 튜브에 추가하여 총 부피를 400마이크로리터로 만듭니다.