기생충에서 약물 유발 세포 독성을 평가하기 위한 β-갈락토시다아제 분석

절대적인 세포내 기생충인 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi)는 포유류 숙주 세포에 트리포마스티고트(편모가 있는 비증식성 발달 단계)로 침입하여 편모가 없는 무스티고트로 분화하여 이원 분열에 의해 세포질에서 증식합니다.

증식 후 아마스티고트는 숙주 세포가 순환계로 들어가도록 방해하여 전신 감염을 일으키는 트리포마스티고트로 다시 분화합니다.

Trypanosoma cruzi에 대한 시험용 구충제의 시험관 내 세포독성 가능성을 평가하기 위해, 효소 β-갈락토시다아제를 안정적으로 발현하는 원하는 발달 단계에 있는 형질전환 Trypanosoma cruzi 기생충의 배양으로 시작합니다.

기생충을 적절한 매체에 현탁시킵니다. 멀티웰 플레이트로 옮깁니다. 적절한 농도의 시험 구충제를 첨가하십시오. 인큐베이트.

약물은 기생충 막을 통해 수동적으로 확산되어 독성 중간체로 대사됩니다. 이러한 대사산물은 핵에 들어가 DNA 손상을 일으켜 β-갈락토시다아제를 포함한 단백질 합성을 억제하여 기생충 생존력에 부정적인 영향을 미칩니다.

흡광도 측정 중 색상 간섭을 방지하기 위해 약물 함유 배지를 완충액으로 교체하십시오. β-갈락토시다아제, 클로로페놀 레드 갈락토피라노사이드, CPRG(무독성 갈락토사이드 유사체)의 기질을 비이온성 순성 세제로 보충합니다. 인큐베이트.

세

제는 기생충을 용해시켜 β-갈락토시다아제를 용액으로 방출합니다. 그 후, β-갈락토시다아제는 CPRG를 가수분해하여 빨간색 침전물인 클로로페놀 레드를 생성합니다.

마이크로플레이트 리더를 사용하여 클로로페놀 레드의 흡광도를 측정합니다. 낮은 흡광도는 낮은 β-갈락토시다제 활성을 나타내며, 이는 특정 농도에서 시험 구충제의 높은 세포독성 가능성을 시사합니다.

텍스트 원고에 설명된 대로 에피마스티고트, 무스티고트가 있는 Vero 세포 또는 트리포마스티고트에 벤즈니다졸 용액을 첨가하십시오. 그런 다음 에피마스티고트를 섭씨 28도에서 72시간 동안 배양하고, 트리포마스티고트 또는 감염된 베로 세포를 아마스티고트와 함께 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 24시간 동안 배양합니다.

비색 분석의 경우 100마이크로리터의 PBS 또는 해당 배지를 추가하여 빈 웰을 설정합니다. 다음으로, 각 웰에서 250마이크로리터의 최종 부피에서 200마이크로몰 CPRG와 0.1% 세제의 최종 농도를 얻기 위해 40마이크로리터의 CPRG 기질 용액과 10마이크로리터의 세제 용액을 각 웰에