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생물학적 기술
0 조회수 • 5:00 분 • July 8th, 2025
내인성 화학 전달체인 모노아민 신경 전달 물질은 뉴런 간의 접촉점인 시냅스를 통해 신호를 전달합니다. 엄격하게 조절된 모노아민 신경전달물질 시스템은 정상적인 신경 기능에 필수적입니다.
생체 외에서 모노아민 방출에 대한 시험 약물의 효과를 스크리닝하기 위해, 조직 생존력을 유지하면서 냉각된 산소화 완충액에 관심 영역을 포함하는 쥐 뇌 조직 절편을 얻습니다.
기체 혼합물 공급에 연결되고 모노아민 산화효소 억제제가 보충된 산소가 함유된 인공 뇌척수액, aCSF를 포함하는 다공성 필터 인서트가 있는 다중 웰 플레이트의 웰로 조직 슬라이스를 옮깁니다. 인큐베이트.
억제제는 세포 내로 확산되고 모노아민 산화효소를 비활성화하여 모노아민의 분해를 방지하고 저장 및 방출에 사용할 수 있는 농도를 증가시킵니다.
조직 함유 인서트를 산소화된 aCSF 및 시험 약물로 구성된 웰로 옮깁니다. 인큐베이트. 이 약물은 모노아민 신경전달물질 시스템을 자극하여 신경외 공간의 모노아민 농도를 증가시켜 뇌 조직에서 용액으로 방출될 수 있습니다.
방출된 모노아민은 다공성 인서트를 통해 웰로 들어가 조직에서 분리됩니다.
배양 후, 조직 슬라이스 함유 인서트를 제거합니다. 고성능 액체 크로마토그래피, HPLC와 호환되는 용매로 구성된 튜브에 모노아민 용액을 수집합니다. 튜브 내용물을 사전 조립된 필터 장치로 옮깁니다. 원심분리기, 주요 오염 물질 제거.
얻은 여과액을 HPLC 컬럼에 로드하고 크로마토그래피 실행을 수행하여 모노아민 방출에 대한 시험 약물 효과를 나타내는 모노아민 농도를 결정합니다.
모노아민 방출을 유도하기 위해, 조직 샘플을 웰당 0.5 내지 1밀리리터의 유출 완충액을 포함하는 맞춤형 48웰 유출 챔버의 각 웰로 옮기고, 일정하고 부드러운 버블링과 함께 샘플이 섭씨 37도에서 30-50분 동안 회수되도록 합니다.
평형 기간이 끝나면, 뇌 조직이 있는 조직 홀더를 약리학적 제제가 있거나 없는 500마이크로리터의 산소화 유출 완충액이 포함된 웰로 이동하고, 웰 가장자리의 홀더를 두드려 웰 사이의 완충액 이동을 최소화하여 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다.
배양이 끝나면 홀더를 관심 약물이 있거나 없는 500마이크로리터의 유출 완충액이 포함된 새로운 웰 세트로 이동하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 20분 동안 추가합니다.
두 번째 배양 동안 첫 번째 배양의 웰에서 얼음 위에 50마이크로리터의 1N 과염소산 또는 인산이 들어 있는 미세 원심분리 튜브로 용액을 옮기고 튜브에 #1을 라벨링합니다.
두 번째 배양이 끝나면 조직 홀더를 얼음 위의 플레이트가 있는 빈 웰로 이동하고 두 번째 배양의 상청액을 얼음 위의 50마이크로리터의 1N 과염소산 또는 인산이 들어 있는 새로운 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 이 튜브에 라벨을 붙입니다 #2.
모든 상청액이 옮겨지면 조직의 각 웰에 얼음처럼 차가운 해부 완충액 1밀리리터를 추가하고 작은 핀셋을 사용하여 각 조직 샘플을 새로운 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 샘플 튜브에서 완충액을 제거하고 조직을 섭씨 -80도에서 보관합니다. 그런 다음 수집된 배양 용액을 원심분리를 위해 미세 원심분리기 필터 튜브로 옮기고 HPLC 분석이 될 때까지 여과액을 얼음 위에 놓습니다.